張偉 孫宗科 魯波 王友斌 丁培 鄭萍 陳西平¹

 中國疾病預防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021

摘要 ：目的 研究4-甲基傘形酮辛酯（MUCAP）試驗檢測水中沙門(mén)菌的靈敏度、特異度和檢出限以及該方法的實(shí)際應用效果。方法 采用“前增菌+選擇性增菌+MUCAP初篩+氧化酶實(shí)驗+血清學(xué)實(shí)驗”的方法，對加標水樣和實(shí)際環(huán)境水樣進(jìn)行檢測。結果 MUCAP試驗的靈敏度為100%，特異度為80.8%，檢出限為1CFU/100ml。結論 采用MUCAP實(shí)驗的方法可以有效的檢出水樣中的沙門(mén)菌，并將實(shí)驗時(shí)間由原來(lái)的72h縮短為48h。

關(guān)鍵詞 ：沙門(mén)菌檢測 MUCAP試驗

中圖分類(lèi)號：                  文獻標識碼： A

 

Institute for Environment Hygiene and Health Related Product Safety, Chinese Center

for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China

Abstract：Objective  To study the sensitivity, specification, detection limit and the practical use of MUCAP method for the detection of salmonella in water.  Methods A comprehensive method of pre-enrichment +selective cultivation + initial screening with MUCAP + oxidase test+ serological test was applied to check salmonella in water samples spiked with bacteria and environmental water samples. Results the sensitivity of MUCAP method was 100%, the specification was 80.8%, and the detection limit was 1CFU/100mL.  Conclusion MUCAP method can effectively identify salmonella in water and the testing time was shortening from 72h to 48h.

Key words：Salmonella，Detection，MUCAP test

 

沙門(mén)菌屬(Salmonella)是一大群寄生于人和動(dòng)物腸道中的形態(tài)、培養特點(diǎn)、生化反應和抗原構造相似的革蘭陰性桿菌，是腸桿菌科中的一個(gè)屬。其分布廣泛，易于繁殖，可對食品、水源等造成污染。沙門(mén)菌感染是近年來(lái)發(fā)生的食源性及水源性食物中毒的重要原因之一，在環(huán)境水體尤其是污水中多有檢出。

沙門(mén)菌傳統的檢測方法是經(jīng)過(guò)選擇性培養后進(jìn)行生化鑒定，一般需要72h，耗時(shí)長(cháng)且操作復雜，因此快速檢測沙門(mén)菌諸如ELISA^[1]、PCR^[2]等方法近來(lái)受到廣泛關(guān)注，其中MUCAP試驗因其操作簡(jiǎn)便且靈敏度高而受到了微生物學(xué)家的重視^[3]。其原理是沙門(mén)菌可以產(chǎn)生辛酯酶，能夠分解4-甲基傘形酮辛酯（MUCAP），釋放出熒光底物4-甲基傘形酮，在366nm紫外光下產(chǎn)生藍色熒光，根據這一特性，可以快速檢測水中是否存在沙門(mén)菌。

本文對MUCAP試驗檢測水體中沙門(mén)菌的靈敏度、特異度和檢出限做了研究并用實(shí)際水樣對該方法的實(shí)際檢測能力進(jìn)行了驗證。

 

1.1.1菌株  試驗菌株來(lái)自本實(shí)驗室保藏的標準菌株和從環(huán)境中分離的菌株，包括：甲型副傷寒沙門(mén)菌（A群），鼠傷寒沙門(mén)菌（B群），豬霍亂沙門(mén)菌（C群），腸炎沙門(mén)菌（D群），山夫登堡沙門(mén)菌（E群）等13株沙門(mén)菌和大腸埃希菌等其他細菌共39株，見(jiàn)表1和表2。

1.1.2培養基  緩沖蛋白胨水、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC增菌液）、連四硫酸鹽增菌液（TTB增菌液）、BS瓊脂培養基、SS瓊脂培養基等均購自OXOID公司。

1.1.3試劑 MUCAP購自北京泰利華科技開(kāi)發(fā)中心。

將細菌劃線(xiàn)接種于SS瓊脂上，37℃培養24h，在單個(gè)菌落上滴加一滴MUCAP試劑，5min內在366nm紫外燈下有藍色熒光產(chǎn)生的為陽(yáng)性結果，否則為陰性。

1.3.1 將沙門(mén)菌在營(yíng)養瓊脂培養基上培養24h后，刮取菌苔用磷酸鹽緩沖液（PBS）配成菌懸液，并進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)帽葷岱ê推桨逵嫈捣▽⒕合♂尩郊s1CFU/ml；

1.3.2取北京市東南二環(huán)護城河水，用本項研究中采用的方法測定水中的沙門(mén)菌，選用經(jīng)MUCAP試驗確定沙門(mén)菌為陰性的水樣，并對該水樣進(jìn)行菌落總數計數；

1.3.3取1ml 1CFU/ml的沙門(mén)菌液加入到99ml護城河水中，混勻后用0.45mm的微孔濾膜過(guò)濾，將濾膜加入到0.1%緩沖蛋白胨水100ml中，37℃振蕩培養6h，各取50ml培養液分別加入到等量雙倍SC和雙倍TTB中，37℃培養18h；

1.3.4取增菌后的液體劃線(xiàn)接種于SS和BS瓊脂上，37℃培養24h，在典型菌落上滴加1滴MUCAP試劑，待1~5min后，置于365nm 紫外燈下觀(guān)察熒光，出現藍綠色熒光為陽(yáng)性反應；

試驗重復10次。

取水樣50份，分別取100ml過(guò)濾后，將濾膜加入到0.1%緩沖蛋白胨水中進(jìn)行前增菌6h，之后用SC和TTB培養基選擇性增菌18h，增菌后在SS和BS瓊脂平板上劃線(xiàn)接種24h，挑取可疑菌落純培養后進(jìn)行生化鑒定，并用血清學(xué)試驗證實(shí)；同時(shí)對所有水樣用MUCAP方法進(jìn)行檢測，并用氧化酶和血清學(xué)試驗證實(shí)。

 

試驗菌株名稱(chēng)	株數	陰性株數
大腸埃希菌	3	3
志賀菌	4	4
腸桿菌	2	2
弗檸檬酸桿菌	1	1
肺炎克雷伯桿菌	1	1
變形桿菌	2	2
蜂房哈夫尼亞菌	1	1
普羅菲登菌	2	2
小腸結腸炎耶爾森菌	1	1
河流弧菌	1	1
副溶血性弧菌	1	1
乙酸鈣不動(dòng)桿菌	1	1
糞產(chǎn)堿桿菌	1	1
銅綠假單胞菌	2	0
粘質(zhì)沙雷菌	1	0
親水氣單胞菌	1	0
糞鏈球菌	1	0
合計	26	21

在本試驗中，13株沙門(mén)菌MUCAP試驗均為陽(yáng)性，實(shí)驗的靈敏度為100%（13/13），蜂房哈夫尼亞菌、粘質(zhì)沙雷菌、親水氣單胞菌和銅綠假單胞菌出現MUCAP試驗陽(yáng)性反應，實(shí)驗的特異度為80.8%（21/26），經(jīng)進(jìn)一步生化試驗，親水氣單胞菌和銅綠假單胞菌可以通過(guò)氧化酶試驗排除是沙門(mén)菌，蜂房哈夫尼亞菌和粘質(zhì)沙雷菌通過(guò)血清學(xué)試驗排除是沙門(mén)菌，如能結合氧化酶試驗和血清學(xué)試驗，將顯著(zhù)提高M(jìn)UCAP試驗的特異度見(jiàn)表1。

在試驗中沙門(mén)菌的加標量及實(shí)驗結果見(jiàn)表2。

注：(1)為10次實(shí)驗結果的平均值，單位為CFU/100ml；(2)“+”表示10次結果中有8次及以上結果出現陽(yáng)性反應

沙門(mén)菌接種量為1～2個(gè)時(shí)，接種到菌落總數為6.22×10⁴/100ml的護城河水中，經(jīng)增菌、劃線(xiàn)接種后沙門(mén)菌可以檢出，認為SC增菌液、TTB增菌液可以從環(huán)境水樣中有效的分離出沙門(mén)菌。考慮到實(shí)際操作中很難以獲得剛好為1CFU/ml的沙門(mén)菌稀釋液，本項試驗中沙門(mén)菌接種量為1.6～1.9 CFU /100ml，可以認為采用緩沖蛋白胨水前增菌、SC增菌液和TTB增菌液選擇性增菌的檢測方法其沙門(mén)菌的檢出率為1CFU/100ml。

從不同的環(huán)境中采集實(shí)際水樣共50份，進(jìn)行沙門(mén)菌的檢測，樣品檢測結果見(jiàn)表3。

Table 3 The results of MUCAP method to check environment water sample 

 

在本項試驗中所取的50件樣品中，通過(guò)常規生化試驗方法鑒定出11株沙門(mén)菌；用MUCAP實(shí)驗法初步鑒定出13株沙門(mén)菌，經(jīng)進(jìn)一步生化鑒定，其中11株為沙門(mén)菌，與常規方法鑒定結果相符合，2株氧化酶實(shí)驗陽(yáng)性，其中1株為氣單胞菌，另1株為銅綠假單胞菌。

 

在本項試驗中用MUCAP試驗檢測本實(shí)驗室保存的沙門(mén)菌和其它細菌，其中所有沙門(mén)菌MUCAP試驗為陽(yáng)性，其它細菌中親水氣單胞菌、銅綠假單胞菌、蜂房哈夫尼亞菌和粘質(zhì)沙雷菌表現為MUCAP試驗陽(yáng)性。對所有陽(yáng)性結果做氧化酶實(shí)驗和血清學(xué)實(shí)驗，其中氣單胞菌屬和假單胞菌屬細菌可以通過(guò)氧化酶實(shí)驗排除是沙門(mén)菌，蜂房哈夫尼亞菌和粘質(zhì)沙雷菌可以通過(guò)沙門(mén)菌血清學(xué)實(shí)驗排除。

在檢測的50件實(shí)際水樣中，常規方法鑒定出11株沙門(mén)菌，用MUCAP實(shí)驗法初步鑒定出13株沙門(mén)菌，經(jīng)進(jìn)一步生化鑒定，其中11株為沙門(mén)菌，2株氧化酶實(shí)驗陽(yáng)性，其中1株為氣單胞菌，另1株為銅綠假單胞菌，這兩種細菌可以通過(guò)氧化酶實(shí)驗排除。

由以上實(shí)驗結果可以認為采用“前增菌+選擇性增菌+MUCAP初篩+氧化酶實(shí)驗+血清學(xué)實(shí)驗”的方法可以有效的檢出水樣中的沙門(mén)菌，檢出限為1CFU/100ml。采用這一方法可以避免復雜的生化鑒定步驟，并將實(shí)驗時(shí)間由原來(lái)的72h縮短為48h。

 

1 黃金林,焦新安,潘志明. 直接酶聯(lián)免疫吸附法和聚合酶鏈反應聯(lián)合檢測沙門(mén)菌的應用[J].中華預防醫學(xué)雜志,2004,38(5):331-334.

2 劉華偉,郭藹光,馬立農,等. PCR技術(shù)在沙門(mén)氏菌快速檢測中的應用[J].動(dòng)物醫學(xué)進(jìn)展,2004,25(6):55-58.

3 褚天新,蘇麗霞,路文彬. MUCAP熒光試驗快速檢測沙門(mén)氏族菌[J].中國公共衛生，2000,16(1):69-70.

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