粗雜糧對大鼠脂代謝紊亂干預作用的機制探討

郭延波 翟成凱1王艷莉 張群 丁舟波 金鑫

東南大學(xué)公共衛生學(xué)院營(yíng)養與食品衛生系，南京 210009

摘要: 目的 觀(guān)察粗雜糧對大鼠脂代謝紊亂及其脂肪組織過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）mRNA表達水平的影響，探討粗雜糧改善脂代謝紊亂的作用機制。方法 44只SPF級大鼠隨機分為陰性對照組（給予常規飼料）和三個(gè)實(shí)驗組（用高脂飼料6周），造模成功后分別給予高脂粗雜糧、高脂米面和高脂模型飼料共15周。結果 粗雜糧高脂組的血清總膽固醇（TC）、總甘油三酯（TG）、白細胞介素-6（IL-6）和C反應蛋白（CRP）顯著(zhù)低于高脂模型組（P<0.05），血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平顯著(zhù)高于高脂模型和米面高脂組（P<0.05），脂蛋白酯酶（LPL）和肝酯酶（HL）活性及腫瘤壞死因子（TNF-α）最接近陰性對照組水平；粗雜糧高脂組白色脂肪組織PPARγmRNA的表達水平明顯高于高脂模型組和米面高脂組（P<0.05）。結論 本文條件下，復配式粗雜糧可以通過(guò)某些途徑激活 PPARγ，促進(jìn)脂肪細胞LPL和HL活性逐步恢復，使血脂水平下降；同時(shí)抑制和減少I(mǎi)L-6、TNF-α及CRP的產(chǎn)生，炎癥反應減輕,脂代謝紊亂得到改善。

關(guān)鍵詞：粗雜糧 PPARγ 膳食干預 脂代謝紊亂

中圖分類(lèi)號：R587.1  R332 文獻標識碼：A

Intervention of Coarse Cereals on lipid metabolism

in rats

Abstract: Objective To observe the effect of coarse cereals on improving the disorder of lipid  metabolism and the expression of PPARγ mRNA in white adipose tissue in rats to investigate the mechanism of coarse cereals on lipid metabolism disorder. Methods Forty four SPF rats were randomly divided into 4 groups: the negative control group was fed with normal diet and 3 experimental groups were fed with high-fat modeling diet for 6 weeks for model building .The 3 experimental groups, the coarse cereals group,rice-flour group and the hyperlipemia model group,were then fed with coarse cereals high-fat diet ,rice-flour high-diet and high-fat modeling diet respectively for another 15 weeks. Results Compared with the hyperlipemia modeling group, serum TG, TC,IL-6 and TNF-α in the coarse cereals group were declined significantly（P<0.05）, Serum HDL-C in coarse cereals group was higher than that in rice-flour group and hyperlipemia model group（P<0.05）,  LPL、HL and TNF-αin coarse cereal group were close to the negative control group.  Moreover, the expression of PPARγmRNA in white adipose tissue of the coarse cereals group was higher than other groups. Conclusion The Coarse cereals could activate PPARγ and enhance the activity of key enzymes in lipids metabolism, so as to reduce the level of TG relieve inflammation and improve lipid dysmetabolism eventually.

Keywords: Coarse cereals ;  PPARγ；Dietary intervention ; Disorder of lipid metabolism

我們的研究結果表明，粗雜糧能夠顯著(zhù)改善實(shí)驗大鼠的脂代謝紊亂^[1]，粗雜糧膳食干預可以有效的改善社區中老年人血脂異常，顯著(zhù)降低脂代謝人群TC、TG、LDL-C水平，增高HDL-C^[2--7]。然而粗雜糧改善血脂代謝紊亂的作用機制目前還不清楚。有研究表明脂質(zhì)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）是一類(lèi)與脂肪形成、糖代謝、炎癥及腫瘤發(fā)生等多種生物過(guò)程有關(guān)，具有復雜功能的核內受體轉錄因子^[8，9]，具有維持體內脂質(zhì)水平穩定的功能。本文通過(guò)觀(guān)察大鼠PPARγ、LPL、HL、IL-6、TNF-α、CRP 、TG、TC、

LDL-C、HDL-C的變化，探討粗雜糧改善脂代謝紊亂的作用機制。

1. 材料與方法

1.1 動(dòng)物與飼料

1.1.1 實(shí)驗動(dòng)物  SPF級近交系雄性SD大鼠44只，體重180g-200g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗動(dòng)物中

心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2003－0005，試驗動(dòng)物質(zhì)量合格證號：0054886。各組飼料的配方見(jiàn)表1。

表1　 四組實(shí)驗動(dòng)物飼料配方的構成⁽¹⁾

Table 1 Dietary components of the four groups g/100g

組別	陰性對照組	粗雜糧組	米面組	高脂模型組
酪蛋白	23	18.5	18.5	18.5
玉米淀粉	29.5	0	0	27.3
蔗糖	31	0	0	28
纖維素	5	5	5	5
豆油	7	0	0	0
豬油	0	10	10	10
蛋黃粉	0	5	5	5
膽固醇	0	1.5	1.5	1.5
膽鹽	0	0.2	0.2	0.2
混合礦物鹽	3	3	3	3
混合維生素	1	1	1	1
DL-蛋氨酸	0.3	0.3	0.3	0.3
氯化膽堿	0.2	0.2	0.2	0.2
粳米	0	0	27.65	0
面粉（標準粉）	0	0	27.65	0
粗雜糧	0	55.3	0	0
供能（Kcal）	303	337	323	339

注： (1)各組飼料能量差異不超過(guò)四組平均值的10％；

陰性對照組供能比：蛋白質(zhì)4.1%，脂肪20.8%，碳水化合物75.1%；

粗雜糧組供能比：蛋白質(zhì)13.0%，脂肪36.5%，碳水化合物50.5%。

米面組供能比：蛋白質(zhì)11.0%，脂肪37.3%，碳水化合物51.7%；

高脂模型組供能比：蛋白質(zhì)4.7%，脂肪34.0%，碳水化合物61.3%；

1.1.2 受試樣品  采用小麥、玉米、高粱、小米和黃豆等為原料,按預試驗比例混合，磨成粉過(guò)60目篩制成復配式粗雜糧面粉；米面粉用粳米磨成粉，面粉為市售標準粉，二者按1：1混合成米面粉。

1.2 主要試劑

總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、脂蛋白脂酶及肝脂酶等試劑盒等均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6和CRP試劑盒購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑TRIZOL( Biouniquer Technology )、半定量RT-PCR 試劑盒（Biouniquer Technology）、焦碳酸二乙酯（DEPC）、瓊脂糖(Spain)、 溴化乙啶（EB）購自南京天為時(shí)代科技有限公司，逆轉錄酶AMV購自Promega 公司。

1.3 試驗方法及檢測指標

1.3.1 試驗方法  受試大鼠適應性喂養一周后按體重隨機分為陰性對照組、粗雜糧高脂組、米面高脂組和高脂模型組，每組11只，陰性對照組給予普通常規飼料, 其他三組給予高脂模型組飼料，連續6周。禁食12-14小時(shí)后晨間斷尾取血。確定造模成功后，米面高脂組和粗雜糧高脂組大鼠分別飼以米面高脂飼料和粗雜糧高脂飼料，其余兩組維持原飼料不變。每周稱(chēng)量大鼠體重及飼料消耗量，連續9周。動(dòng)物禁食不禁水12 h，股動(dòng)脈取血處死，3000rpm離心10分鐘分離血清，-20℃冰箱保存，腎周脂肪組織貯存于-80℃冰箱備用。

1.3.2 檢測指標及方法  Enzymatic-trinder法測定TC，甘油磷酸氧化酶法測定TG，膽固醇氧化酶法測定HDL-C，用Friede wald公式計算LDL-C，比色測定法測定HL 及L PL ^[10] ，放射免疫法測定TNF-α、IL-6。雙抗夾心Elisa法測定CRP。

1.3.3 脂肪組織PPARγmRNA表達水平的測定：引物設計根據Genebank中β-actin 、PPARγmRNA的全序列及參考文獻^[11]，并利用計算機輔助設計，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 數據處理

采用SAS 8.0統計軟件分析數據，數據以±S表示，采用one-way ANOVA 進(jìn)行顯著(zhù)性檢驗，組間比較采用DUNNET-t檢驗，差異顯著(zhù)性設定為P＜0.05。

2. 結果

2.1粗雜糧對脂代謝紊亂大鼠血脂水平的影響

實(shí)驗前，各組間TC、TG、HDL-C和LDL-C水平無(wú)顯著(zhù)性差異（P＞0.05），實(shí)驗第15周，粗雜糧高脂組TC、TG、LDL-C水平顯著(zhù)低于高脂模型和米面高脂組（P＜0.05）；粗雜糧高脂組HDL-C水平顯著(zhù)高于高脂模型和米面高脂組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 粗雜糧對血脂水平的影響（±S）

Table_ 2 Effect of the coarse cereals on blood lipids of rates mmol/L

注：a 與陰性對照組相比 P＜0.05； b 與高脂模型組相比P＜0.05； c 與米面高脂組相比  P＜0.05

2．2 粗雜糧對脂代謝紊亂大鼠炎性因子的影響

實(shí)驗前，各組TNF-α、IL-6、CRP水平無(wú)顯著(zhù)性差異（P＞0.05），實(shí)驗第15周，高脂模型組大鼠IL-6、TNF-α、CRP水平顯著(zhù)高于陰性對照組（P＜0.05）；粗雜糧高脂組大鼠IL-6、CRP水平顯著(zhù)低于高脂模型和米面高脂組（P＜0.05），與陰性對照組最接近。見(jiàn)表3。

表3 粗雜糧對大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP的影響（±S）

Table 3 Effect of coarse cereals on IL-6、TNF-α and CRPof rates（±S）

組別	動(dòng)物數	IL-6（pg/ml）		TNF-α（ng/ml）		CRP(μg/mL)
		實(shí)驗前	實(shí)驗后	實(shí)驗前	實(shí)驗后	實(shí)驗前	實(shí)驗后
陰性對照組	11	32.65±7.80	72.62±17.92	0.84±0.48	1.36±0.43	199. 90 ±6. 25	203.74±7.44
粗雜糧高脂組	11	28.17±6.57	70.53±17.37bc	0.86±0.35	1.45±0.82	198. 30 ±5. 72	242.12±4.22b,c
米面高脂組	11	29.77±9.14	89.35±13.12a	0.85±0.30	1.75±0.37	202. 63 ±7. 03	288.41±6.17a
高脂模型組	11	31.47±10.79	99.92±10.39a	0.85±0.40	2.06±0.75a	200. 50 ±6. 88	327.69±4.22a

注：a 與陰性對照組相比 P＜0.05； b 與高脂模型組相比P＜0.05；  c 與米面高脂組相比 P＜0.05

2.3 粗雜糧對脂代謝紊亂大鼠LPL、HL的影響

LPL和HL的活性均呈現出陰性對照組最高，高脂模型組最低，粗雜糧高脂組與陰性對照組最接近.詳見(jiàn)表4。

表4 粗雜糧對大鼠LPL和HL的影響（±S）

Table 4 Effect of coarse cereals on LPL and HL of rates（±S）

組別	動(dòng)物數	LPL	HL（IU/ml）
陰性對照組	11	2.36±1.15	3.21±1.73
粗雜糧高脂組	11	2.11±1.40	2.74±0.92
米面高脂組	11	1.87±0.57	2.34±0.92
高脂模型組	11	1.68±0.71	2.25±1.42

2.4 脂代謝紊亂大鼠脂肪組織PPARγmRNA表達水平的比較

實(shí)驗15周后各組大鼠白色脂肪組織PPARγmRNA表達水平不同，粗雜糧組PPARγmRNA的表達水平顯著(zhù)高于高脂模型和米面高脂組，陰性對照組大鼠PPARγmRNA表達水平最低。詳見(jiàn)表5及圖1

表5 粗雜糧對大鼠脂肪組織PPARγ表達的影響（±S）

Table 5  Effect of the coarse cereals on the expression of PPARγ in adipose tissue of rates（±S）

組別	動(dòng)物數	PPARγ表達量
陰性對照組	11	0.05±0.03
粗雜糧高脂組	11	0.24±0.03ab c
米面高脂組	11	0.13±0.04 a
高脂模型組	11	0.09±0.02 a

注：a與陰性對照組相比P＜0.05；b與高脂模型組相比P＜0.05；c與米面高脂組相比P＜0.05

3. 討論：

3.1.粗雜糧對脂代謝紊亂的改善作用

本文表2結果顯示，與高脂模型組及米面高脂組相比較，粗雜糧高脂組TC、TG、LDL-C水平最低，HDL-C水平最高（P＜0.05），與陰性對照組最接近。與陰性對照組相比，高脂肪模型組TC、TG、LDL-C水平最高，HDL-C水平最低（P＜0.05）。米面高脂組與高脂模型組之間血脂水平無(wú)顯著(zhù)性差異，提示粗雜糧可降低脂代謝紊亂大鼠血脂水平，與我們以往的研究結果一致^[1]。

3.2 粗雜糧抑制炎癥因子水平的升高

目前已經(jīng)達成共識的是，脂代謝紊亂呈現出非典型的炎癥反應，炎癥因子與脂肪內分泌、氧化應

激、免疫系統相互作用，介導糖脂代謝紊亂的發(fā)生^[12]。本文表3結果顯示，高脂模型組IL-6、TNF-α和CRP的水平最高，陰性對照組最低（P＜0.05）；粗雜糧組IL-6、TNF-α和CRP的水平較低，顯著(zhù)低于高脂模型組（P＜0.05），最接于陰性對照組。表明高脂膳食可以使體內炎癥因子的水平升高，這與王艷莉等^[13]的研究結果一致。本文結果提示粗雜糧可以通過(guò)某些途徑抑制炎癥因子水平的升高，改善機體的炎癥損傷。有研究表明激活的PPARγ可以通過(guò)促進(jìn)白色脂肪細胞的分化，對激動(dòng)蛋白-1(AP-1)、核因子-κB(NF-κB)、轉錄信號傳感及激活因子1 (STAT1)的干涉，抑制大多數致炎反應基因的轉錄活性，減少單核細胞分泌IL-6、TNF-α及CRP等細胞因子^[14]，從而改善脂代謝紊亂。

3.3粗雜糧促進(jìn)LPL和HL活性的恢復

LPL和HL的活性與脂肪代謝調控密切相關(guān)，是影響乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)代謝的關(guān)鍵因子，LPL水平的異常低值被認為是高TG血癥的原因之一^[15，16]。本文表4結果顯示，高脂模型組LPL和HL活性最低，陰性對照組活性最高，粗雜糧高脂組LPL和HL活性高于高脂模型組，最接近于陰性對照組。提示高脂膳食干預可以抑制LPL和HL的活性，這與賈乙^[17]等的結果一致；而粗雜糧干預可以促進(jìn)LPL和HL活性的恢復，促進(jìn)體內脂質(zhì)成分的分解。其可能的機制是粗雜糧促進(jìn)了LPL和HL上游基因的表達。

近來(lái)的研究發(fā)現^[18]LPL的功能受PPAR-γ的調節，激活的PPARγ通過(guò)與類(lèi)維甲酸受體（RXR）形成雜二聚體而誘導脂肪細胞中LPLmRNA表達。增加體內LPL的活性。

3.4 粗雜糧促進(jìn)PPARγ的表達

本文表5和圖1結果顯示，陰性對照組PPARγmRNA表達水平最低，高脂模型組PPARγmRNA表達量高于陰性對照組，粗雜糧組PPARγmRNA表達水平顯著(zhù)高于高脂模型組和米面組及陰性對照組（P＜0.05），提示粗雜糧可以通過(guò)某些途徑促進(jìn)PPARγmRNA的表達。有研究發(fā)現來(lái)源于飲食和機體的代謝產(chǎn)物如長(cháng)鏈脂肪酸尤其是多不飽和脂肪酸^[19],如亞油酸、花生四烯酸等可以作為配體與PPARγ結合激活其表達。本研究中復配式粗雜糧以富含多不飽和脂肪酸的黃豆、玉米、小麥、高粱和小米等制成，構成PPARγ的天然配體，與PPARγ結合促進(jìn)其mRNA的表達。從而改善脂代謝紊亂。

3.5 復配式粗雜糧改善脂代謝紊亂的作用機制初探

高脂膳食干預可使SD大鼠LPL和HL等脂質(zhì)代謝酶的活性降低，同時(shí)高脂膳食又導致了多種炎癥因子如IL-6、TNF-α和CRP等的增加，而這些炎癥因子又抑制了LPL的活性，使大鼠體內脂質(zhì)代謝發(fā)生障礙，脂質(zhì)成分不能充分代謝而堆積。此時(shí)機體可以通過(guò)代償性反饋，使PPARγ表達增強促進(jìn)體內脂質(zhì)在脂肪細胞中的儲存，表現為高脂模型組的PPARγ表達高于陰性對照組。但僅通過(guò)自身的代償尚不能完全分解體內過(guò)多的脂質(zhì)，最終發(fā)生脂代謝紊亂，表現為血清中TC、TG和LDL水平上升，HDL-C水平降低。

當給予粗雜糧干預后，復配式粗雜糧中的某些成份或其在體內的代謝產(chǎn)物可以作為PPARγ的配體激活PPARγ而促進(jìn)其mRNA表達，隨后通過(guò)兩條途徑改善脂代謝紊亂。首先PPARγ與 RXR 形成雜二聚體并與LPL基因的過(guò)氧化物酶體增殖物反應元件相結合，誘導脂肪細胞中LPLmRNA表達，使體內LPL含量升高，加速對脂肪的分解，使血漿甘油三酯水平下降。第二條途徑是激活的PPARγ可以通過(guò)促進(jìn)白色脂肪細胞的分化，對激動(dòng)蛋白-1(AP-1)、核因子-κB(NF-κB)、轉錄信號傳感及激活因子1 (STAT1)的干涉，抑制大多數致炎反應基因的轉錄活性，減少I(mǎi)L-6 、TNF-α及CRP等炎癥因子的產(chǎn)生，同時(shí)炎癥因子的減少又可以削弱對LPL活性的抑制。即在改善機體炎癥損傷的同時(shí)恢復LPL的活性，最終起到雙重改善脂代謝紊亂的作用。詳細機制見(jiàn)圖2。

由本文可知，復配式粗雜糧可以激活PPARγ改善脂代謝紊亂，但對復配式粗雜糧調控PPARγ表達的作用機制及其在體內的代謝過(guò)程有待進(jìn)一步深入研究。

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