覃倚瑩  吳暉  肖性龍[1]^,2  余以剛  張經(jīng)緯²

華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣州 510640

 

摘要：目的 針對霍亂弧菌血清群各自編碼O抗原的特異性基因建立能夠快速、準確地同時(shí)檢測O1和O139群霍亂弧菌的熒光PCR檢測方法，并克服常用PCR檢測方法中經(jīng)常出現的假陽(yáng)性現象。方法 分別以rfbM和wbfR基因作為O1和O139群霍亂弧菌的模板設計引物和探針，通過(guò)優(yōu)化反應條件建立了能夠同時(shí)檢測O1群和O139群霍亂弧菌的二聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。對該方法的特異性、靈敏度進(jìn)行評估，并對10份模擬食品樣品和133份臨床樣品進(jìn)行了檢測。結果 特異性試驗表明，該方法能選擇性檢測O1和O139群霍亂弧菌，能有效地避免O141群霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌的假陽(yáng)性，特異性為100%；靈敏度試驗表明，O1群霍亂弧菌和O139群霍亂弧菌檢出限分別為92CFU/ml和116CFU/ml；另外，試驗建立的檢測方法對模擬樣品和臨床樣品檢測結果與國標法的檢測結果完全一致，符合率為100%。結論本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法能夠同時(shí)檢測O1和O139群霍亂弧菌，而且特異性好、靈敏度高，能有效克服假陽(yáng)性，適用于基層疾病控制、口岸檢疫單位日常疫情監測和臨床診斷。

關(guān)鍵字：霍亂弧菌   實(shí)時(shí)熒光定量PCR   rfbM基因   wbfR基因   TaqMan探針

中圖分類(lèi)號： Q593.1                  文獻標識碼：A

QIN Yiying, WU Hui, XIAO Xinglong, YU Yigang, ZHANG Jingwei

College of Light Industry & Food, South China University of Technology, Guangzhou  510640，China

 

Abstract: Objective Targeting the specific O-antigen Gene cluster, a Taq-Man real-time fluorescence PCR assay was developed to detect O1 and O139 Vibrio cholera concurrently and avoid frequently occurred false positives. Method We designed two pairs of specific primers and two TaqMan fluorescent probes respectively targeting rfbM gene of Vibrio cholerae O1 and wbfR of O139. After optimization of conditions, we evaluated the specialty and sensitivity of the detection method and tested ten simulated food samples and 128 clinical samples. Result The detection limits of Vibrio cholerae O1 and O139 are 92 CFU/mL and 116 CFU/mL, which are almost the same with the usual PCR method. The developed real-time fluorescence PCR protocol detect only Vibrio cholerae O1 and O139 and it is not affected by many normal food pathogens such as Staphylococcus aureus and Salmonella, especially Vibrio cholerae O141which contained TCP genes and Vibrio mimicus which contained ZOT gene. The clinical detect results of the developed assay and routine culture method are exactly the same. [Conclusion] The developed detection assay can quantitatively detect Vibrio cholerae O1 and O139 concurrently in only 3 hours, and can avoid false positive, and thus is an efficacious method for detecting Vibrio cholerae O1 and O139 and can be used in a wide area such as entry-exit inspection and quarantine, food safety detection and clinical diagnose.

Key words: Vibrio cholerae O1 and O139，Real-time fluorescence PCR，rfbM gene，wbfR gene，TaqMan-based probe

 

霍亂弧菌（Vibrio cholerae，Vc）能夠引起一種烈性傳染病--霍亂。霍亂發(fā)病急、傳播快、波及面積廣，危害十分嚴重，是我國法定報告的甲類(lèi)傳染病和國際檢疫傳染病中最為嚴重的一種，如搶救不及時(shí)或不得當，可于發(fā)病后數小時(shí)至十多個(gè)小時(shí)內死亡，嚴重威脅公眾的人生安全，因此快速、準確和靈敏地檢測霍亂弧菌至關(guān)重要^[1]。

雖然霍亂弧菌有200多個(gè)血清型，但是只有O1和O139群霍亂弧菌可引起霍亂大流行^[2-3]。而作為國際檢疫傳染病——霍亂的病原診斷，以檢出O1群霍亂弧菌或O139群霍亂弧菌為準^[4]。因此建立同時(shí)檢測食品中O1和O139群霍亂弧菌的方法，可以讓O1和O139群霍亂弧菌的檢測一步完成，省時(shí)省力，對保障食品安全、防治霍亂流行具有重大意義。

Taq-man實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法特異性強、靈敏度高、所需時(shí)間短、而且可以定量檢測，受到高度重視。對霍亂弧菌的PCR檢測一般是以各種毒力基因為靶基因建立的單重或多重PCR，但是許多研究表明，毒力基因特異性不夠高，以其為靶基因建立的檢測方法容易造成假陽(yáng)性。

本實(shí)驗針對霍亂弧菌血清群各自編碼O抗原的特異性基因，O139群霍亂弧菌以wbfR為模板，O1群霍亂弧菌以rfbM為模板設計引物和探針建立快速、同時(shí)檢測O1和O139群霍亂弧菌的二聯(lián)實(shí)時(shí)熒光PCR方法，克服由于毒力基因特異性不夠高造成的假陽(yáng)性。

 

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及樣本  O1和O139群霍亂弧菌、沙門(mén)菌(Salmonella)、志賀菌(Shigella dysenteriae)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）、創(chuàng )傷弧菌（Vibrio vulnificu）、溶藻弧菌（vibrio alginolyticus）等由深圳出入境檢驗檢疫局的實(shí)驗室（SZCIQ）和美國典型培養物保藏中心(（ATCC）提供，非O1和O139群霍亂弧菌由深圳太太基因工程有限公司（SZTT）提供；收集來(lái)自廣東省水產(chǎn)基地以及市售的多種咸水及淡水魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)及貝殼類(lèi)等水產(chǎn)品樣本120份，2008年9月以來(lái)由沙門(mén)菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌等腸道細菌引起的臨床腹瀉樣本13份。

1.1.2 試劑  Taq酶（MBI）、TrisCl、EDTA、SDS、苯酚、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、Free RNase水等常規試劑（分析純）以及DNA提取液。

1.1.3 儀器  ABI7500HT熒光定量PCR儀，移液槍?zhuān)?000μl、200μl、20μl、2.5μl），低溫微量超速離心機，水浴鍋，渦旋振蕩器等。

根據霍亂弧菌O1和O139血清群各自的特異基因，確定rfbM、wbfR基因序列片段分別作為它們實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針設計的模板。從GenBank上獲得O1群霍亂弧菌rfbM基因序列和O139群霍亂弧菌wbfR基因序列，分別采用DNAStar軟件中的Seqman進(jìn)行同源性分析，確定在群內保守而群間特異的片段，再運用ABI的Primer Express及DNAStar中的PrimerSelect軟件設計引物和探針。引物和探針由上海生物工程有限公司合成。

取待測樣本增菌液1ml加到1.5ml無(wú)菌離心管中，8 000r/min離心4min，盡量吸干上清；加入50μl DNA提取液，振蕩混勻后沸水浴5min，13 000r/min離心5min；轉移上清液并保存在-20℃備用。

參照MBI公司產(chǎn)品Taq酶（#EP0402）說(shuō)明書(shū)，將熒光定量PCR上游引物、下游引物和探針同時(shí)加入反應體系中，于A(yíng)BI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴增。對熒光定量PCR反應體系中各組分濃度和反應程序進(jìn)行優(yōu)化，特別是對引物和探針濃度進(jìn)行篩選。

以沙門(mén)菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌、創(chuàng )傷弧菌、溶藻弧菌等多種感染人的食源性致病菌作為陰性對照菌株，并用高純水作為無(wú)模板空白對照（No template control，NTC），驗證所建立的O1和O139群霍亂弧菌二聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的特異性。

將待測菌株用堿性蛋白胨水37℃培養6~8h后，依次將原菌液稀釋至10^-5~10^-8各個(gè)濃度梯度，從各濃度取50μl菌液涂平板，3個(gè)平行，取各濃度菌液10μl作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。然后統計平板上長(cháng)出的菌落個(gè)數，結合相對應的實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測結果，計算出該檢測方法的敏感性。

選取傳統檢測方法預檢為O1和O139群霍亂弧菌陰性的魚(yú)肉、蝦肉10g與90ml堿性蛋白胨水制成勻漿，取10ml魚(yú)蝦肉勻漿10份，分別接入1ml不同濃度的O1和O139群霍亂弧菌菌液，混勻作為模擬食品樣品，取1ml的增菌液提取DNA模板后用實(shí)驗建立的方法進(jìn)行檢測。同時(shí)采用傳統培養法進(jìn)行霍亂弧菌檢測。

用滅菌棉拭子沾取堿性蛋白胨水涂抹收集到的120份水產(chǎn)品樣本的表面，將棉拭子置于8~10ml堿性蛋白胨水中37℃培養6~8h后用實(shí)驗建立的方法進(jìn)行檢測。同時(shí)采用傳統培養法進(jìn)行霍亂弧菌檢測。

將收集到的13份臨床腹瀉樣本加入8~10ml堿性蛋白胨水中37℃培養6~8h后用實(shí)驗建立的方法進(jìn)行檢測。同時(shí)采用傳統培養法進(jìn)行霍亂弧菌檢測。

 

設計的多對引物探針組合經(jīng)實(shí)驗篩選優(yōu)化，獲得最佳引物探針組合，作為本方法中的引物和探針，其序列和特征見(jiàn)表1。

菌株	名稱(chēng)	序列（5’-3’）	長(cháng)度（bp）	熔解溫度（℃）
Vibrio cholerae O1	Primer F605	CAC GCC ATT GAA GGT TAT GTC TC	23	59.5
	Primer R703	AAA TTG ATG TCG ATA GCG GTA GAT TA	26	58.3
	Probe Pb645	FAM-CCG CCT GCT CAG CAA AAG TAT TCA TCA-TAMRA	27	68.5
Vibrio cholerae O139	Primer F997	CAG TTA CCT GTT ATG TAC GAT GAA CCT	27	57.8
	Primer R1106	CCA TCA CCA GAC AAG CAT ACA GT	23	57.7
	Probe Pb1025	FAM- TGC TGA CGC CTC TCA AGT GCC TAC G-TAMRA	25	69.2

The primers and probes are synthesized by Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd.

 

設計的引物和探針序列輸入GenBank數據庫運行Blast程序，比對結果顯示，分別針對O1群和O139群霍亂弧菌設計的引物和探針序列在各自的血清群內是高度保守的，而對于其它血清群及物種又同時(shí)高度特異，因此理論上都具有特異的擴增效果。

引物和探針濃度篩選試驗結果表明，采用O1群霍亂弧菌的引物濃度和探針濃度分別為0.7μmol/L和0.3μmol/L，O139群霍亂弧菌的引物濃度和探針濃度分別為0.5μmol/和0.2μmol/L進(jìn)行檢測，獲得的Ct值最小且熒光增量（△Rn）較大。對熒光定量PCR反應體系中其余各組分濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定各組分用量/濃度為(25μl)：Taq 酶2.5U，1×緩沖液（含有鎂離子），dNTP混合液0.4mmol/L，模板DNA 2μl。優(yōu)化后的反應程序為：95℃變性2min，以95℃、15s，60℃、1min（收集FAM熒光信號）擴增40個(gè)循環(huán)，反應時(shí)間為1.5h。

利用本研究建立的O1和O139群霍亂弧菌二聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法對O1和O139群霍亂弧菌，和沙門(mén)菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌、創(chuàng )傷弧菌、溶藻弧菌以及以毒力基因為靶基因建立的熒光PCR檢測方法容易出現假陽(yáng)性的O110和O141群霍亂弧菌等14株陰性對照菌株進(jìn)行檢測。結果顯示只有O1群和O139群霍亂弧菌出現典型的擴增曲線(xiàn)，而其他14株菌株和空白對照均為一平直線(xiàn)，Ct值無(wú)法讀取（Undet.），判為陰性。該檢測結果與傳統的生化檢測方法結果完全一致（表2，圖1），說(shuō)明所建立的二聯(lián)熒光PCR檢測方法對O1和O139群霍亂弧菌的檢測特異性為100%。

菌株	來(lái)源	Ct	傳統檢測方法(1)
Vibrio cholerae O139	SZCIQ 5144	20	＋
Vibrio cholerae O1	SZCIQ 7326	22	＋
Vibrio cholerae O110	SZTT 0125	Undet.	－
Vibrio cholerae O141	SZTT 0146	Undet.	－
vibrio mimicus	ATCC33653	Undet.	－
Vibrio vulnificu	ATCC27562	Undet.	－
vibrio alginolyticus	ATCC17749	Undet.	－
Campylobacter jejuni	SZCIQ 11213	Undet.	－
Staphylococcus aureus	SZCIQ 6538	Undet.	－
E.coli O157:H7	SZCIQ 13813	Undet.	－
Salmonella.spp	ATCC 9089	Undet.	－
Listeria monocytogenes	SZCIQ 7644	Undet.	－
Shigella dysenteriae	SZCIQ 4376	Undet.	－
Vibrio parahaemolyticus	SZCIQ 4242	Undet.	－
Enterobacter sakazakii	SZCIQ 0013	Undet.	－
Klebsiella oxytoca	SZCIQ 45103	Undet.	－

 

 

 

 

實(shí)驗結果如表3所示。由于用O1群霍亂弧菌涂板的菌液是50μl，10^-6稀釋度平均長(cháng)出46個(gè)菌落，而用于檢測的菌液是10μl，該10μl的菌液中理論含菌量0.92個(gè)細菌，即實(shí)驗建立的檢測方法對O1群霍亂弧菌的靈敏度的理論極限是92CFU/ml。同理，O139群霍亂弧菌的靈敏度的理論極限是116CFU/ml。實(shí)驗建立的二聯(lián)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的靈敏度與常用的檢測方法相似，一次反應檢出陽(yáng)性細菌細胞的靈敏度達到個(gè)位細胞數。

菌株	梯度濃度	平均數	涂板用量 （μl）	檢測用量 （μl）	Ct	靈敏度 （CFU/ml）
Vibrio cholerae O1	10-5	494	50	10	30.44	92
	10-6	46	50	10	33.05
	10-7	5	50	10	37.13
	10-8	0	50	10	Undet.
Vibrio cholerae O139	10-5	605	50	10	29.64	116
	10-6	58	50	10	32.48
	10-7	6	50	10	36.29
	10-8	0	50	10	Undet.

 

利用本研究建立的FQ-PCR方法以及傳統檢測方法對10份模擬樣品、120份淡水、咸水樣品和13份嘔吐物進(jìn)行檢測，實(shí)驗結果表明，實(shí)驗建立二聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法能夠同時(shí)檢測O1和O139群霍亂弧菌，其結果與傳統的檢測方法符合率為100%，具有廣泛而良好的適用性。

樣品名稱(chēng)	檢驗數	陽(yáng)性樣品				與傳統檢測方法的符合率
		FQ-PCR	傳統檢測法
			Vc O1	Vc O139	Vc O1 and O139
模擬樣品	10	10	3	3	4	100%
淡水、咸水樣品	120	3	2	0	1
嘔吐物	13	5	3	2	0

 

現有的關(guān)于同時(shí)檢測O1和O139群霍亂弧菌的研究主要包括普通PCR和其他PCR包括熒光PCR、巢式PCR、原位PCR等。普通PCR需要進(jìn)行電泳，費時(shí)費力，而且電泳過(guò)程容易污染而造成假陽(yáng)性，電泳所用的試劑毒性極大，對人員的安全造成很大的威脅。而熒光PCR由于不需要后續的處理，而且靈敏度高，特異性強在微生物檢測上得到越來(lái)越多的應用。對霍亂弧菌的PCR檢測一般是針對霍亂毒素元件（CTX）、霍亂毒素共調菌毛（TCP）、毒素表達調控蛋白（toxR）、RTX等毒力基因設計引物進(jìn)行單重或多重PCR^[6-8]。但是有研究指出產(chǎn)毒素的非霍亂弧菌以及非O1，非O139群霍亂弧菌也有可能含有這些毒力基因^[9]。KATSUAKI等以rfb和ctxA作為靶基因設計引物建立了O1和O139群霍亂弧菌的普通PCR檢測方法，其中O37、O105、O141和O191群霍亂弧菌表現為ctxA陽(yáng)性^[10]。GEORGE針對ctxAB基因設計引物和探針建立的熒光PCR檢測方法能夠檢測出O1和O139群霍亂弧菌的同時(shí)也能檢測O141群霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌^[11]。DALSGAARD等研究表明霍亂弧菌O141含有TCP基因和CTX前噬菌體^[12]。GUHATHAKURTA等研究表明，非O1和O139群霍亂弧菌也含有編碼毒素表達調控蛋白的基因（toxR）^[13]。CHOWDHURY等指出，擬態(tài)弧菌含有O1型霍亂弧菌中編碼腸毒素的zot基因^[14]。因此針對這些毒力基因建立的檢測方法可能造成假陽(yáng)性。

O抗原是自然界中最具多樣性的分子之一，它決定著(zhù)霍亂弧菌的血清學(xué)分類(lèi)，具有高度的特異性。Hoshino 等以rfb和ctxA作為靶基因設計引物建立了O1和O139群霍亂弧菌的普通PCR檢測方法，試驗中所有O1和O139群霍亂弧菌均為rfb陽(yáng)性^[10]。王曉梅根據O1群和O139群霍亂弧菌抗原編碼基因rfb序列設計引物，利用SYBR Green染料，建立同時(shí)檢測霍亂弧菌O1群和O139群的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法^[15]，該方法特異性為100%。

O139群霍亂弧菌是O1群霍亂弧菌的變種，其中，O139群霍亂弧菌的rfb基因由wbf基因取代^[10,16]。本試驗確定rfbM、wbfR基因序列片段分別作為O1群和O139群霍亂弧菌的模板設計引物和探針建立同時(shí)檢測O1和O139霍亂弧菌的Taq-Man實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，其中，Taq-Man實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法由于引物和探針的雙重保險，特異性更強。BLAST結果也顯示我們選取的rfbM、wbfR基因片斷高度保守，實(shí)驗結果也證明了基于rfbM、wbfR基因的FQ-PCR檢測特異性為100%。

本研究所建立的熒光PCR檢測方法克服了普通PCR檢測方法的缺點(diǎn)，而且針對特異性更強的編碼O抗原的基因設計引物探針，能夠同時(shí)檢出O1和O139群霍亂弧菌，檢測限達到了個(gè)位細胞，特異性強，能夠有效地克服假陽(yáng)性和漏檢，操作簡(jiǎn)單需時(shí)短，將為O1群和O139群霍亂弧菌進(jìn)行流行病學(xué)調查提供有力的工具，適用于進(jìn)出口檢驗檢疫、食品安全檢測、病原體的臨床診斷（疾病的臨床早期診斷，病原微生物的含量分析等）、基礎理論研究（SNP篩查，基因分型等）等領(lǐng)域,應用前景廣闊。

 

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