復配式粗雜糧對大鼠胰島素抵抗及PPARγ表達的影響

丁舟波，王曉飛，翟成凱*，金鑫，張群，郭延波

（東南大學(xué)公共衛生學(xué)院營(yíng)養與食品衛生學(xué)系，南京210009）

摘要：目的 掌握復配式粗雜糧對高脂飲食誘導的大鼠胰島素抵抗的影響。 方法 40只SD大鼠隨機分為陰性對照組(n=10)和高脂造模組(n=30)，分別給予基礎飼料和高脂飼料，6周后再將高脂造模組分為高脂模型對照組、米面組、粗雜糧組(n=10)，提供相應飼料。繼續喂養9周后，測定大鼠血糖和胰島素水平，RT-PCR法測定脂肪組織中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ) mRNA表達。結果 6周高脂飲食后，高脂造模組胰島素指數(HOMA-IR)明顯升高，造模成功。粗雜糧組大鼠的體重和HOMA-IR顯著(zhù)低于高脂模型對照組和米面組，粗雜糧組PPARγ mRNA的表達與其他三組比較明顯增加（P<0.05）。 結論 復配式粗雜糧能顯著(zhù)降低高脂飲食引起的胰島素抵抗大鼠的血糖、胰島素水平，改善胰島素敏感性，其機制可能與增加PPARγ的表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】復配式粗雜糧；胰島素抵抗；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ

Effect of compound coarse grain food on insulin resistance and expression of PPARγ in rat

Ding Zhou-bo, Zhai Cheng-kai, Wang Xiao-fei, Jin Xin, Zhang Qun, Guo Yan-bo

(School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009)

Abstract:  Objective To explore the effect of compound coarse grain food on insulin resistance (IR) in rats. Methods Forty Sprague-Dawlay rats were randomly divided into normal control group (n=10) and model group (n=30), provided regular diet and high fat diet separately. After 6 weeks, the model group were divided into high fat diet group, rice flour group and coarse grain group, and provided the corresponding feed. After feeding 9 weeks, the fasting blood glucose, insulin and the expression of PPAR-γ mRNA in rats were measured. Results IR was successfully induced by 6-weeks high fat diet. The body weight and insulin resistance index (HOMA-IR) in coarse grain group were significantly lower than high fat diet group and rice flour group. The

基金項目：國家自然基金項目（30872118），江蘇省社會(huì )發(fā)展項目（BS2006047），江蘇省衛生廳科研重大項目（K200606）

作者簡(jiǎn)介：丁舟波（1983- ），女，碩士研究生，研究方向：營(yíng)養與慢性病，Email：dingzhoubo@yahoo.com.cn，聯(lián)系電話(huà)：02583272560

*通訊作者：翟成凱，博導，Email：zck@seu.edu.cn

expression of PPAR-γ mRNA in coarse grain group was significantly higher than other three groups (P<0.05). Conclusion The coarse grain food can reduce the concentration of blood glucose and insulin in rat

with insulin resistance induced by high-fat dietary, and improve insulin sensitivity. The possible mechanism is the over-expression of PPAR-γ.

Key words: compound coarse grain food; insulin resistance; PPAR-γ

胰島素抵抗（insulin resistance, IR）是指胰島素的外周靶組織（主要為骨骼肌、肝臟和脂肪組織）對外源性胰島素的敏感性和/或反應性降低，導致生理劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常的生理效應。如何預防和改善胰島素抵抗是目前的研究熱點(diǎn)。復配式粗雜糧的人群應用結果顯示，該食物對血糖影響較小^[1]，動(dòng)物實(shí)驗顯示，復配式粗雜糧對脂代謝紊亂大鼠的脂代謝有較好的改善作用^[2]，提示復配式粗雜糧有改善胰島素抵抗的作用。本文觀(guān)察復配式粗雜糧對胰島素抵抗大鼠空腹血糖、胰島素等生化指標的作用，以及對基因PPARγ表達的影響，探討復配式粗雜糧改善胰島素抵抗的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品與試劑  小麥、玉米、高粱、小米和黃豆等原料按比例混合，再磨碎成粉（過(guò)60目篩）制成復配式粗雜糧面粉；粳米磨成粉，面粉系標準粉，二者按1：1混合成米面粉。胰島素試劑盒：北京科美東雅生物技術(shù)有限公司；葡萄糖試劑盒：南京建成生物工程研究所。PCR所需試劑：南京天為時(shí)代科技有限公司；PCR引物：上海生工生物科技服務(wù)有限公司；瓊脂糖：sigma公司。

1.1.2飼料配方  采用完全配方飼料。其中陰性對照組飼料參照美國營(yíng)養學(xué)會(huì )推薦的AIN-93M實(shí)驗動(dòng)物合成飼料配方配制而成，在此基礎上適當調整蛋白質(zhì)和蔗糖的比例，增加飽和脂肪酸含量，制成高脂飼料^[3]；同時(shí)用粳米粉、面粉和粗雜糧粉代替高脂飼料中蔗糖和淀粉部分，配制成米面組飼料和粗雜糧組飼料。

表1　 四組實(shí)驗動(dòng)物飼料配方的構成（每100克)

Table 1 Diet composition of the four groups（per 100g）

組別	陰性對照組	高脂對照組	米面組	粗雜糧組
酪蛋白	23	18.5	18.5	18.5
玉米淀粉	29.5	27.3	0	0
蔗糖	31	28	0	0
纖維素	5	5	5	5
豆油	7	0	0	0
豬油	0	10	10	10
蛋黃粉	0	5	5	5
膽固醇	0	1.5	1.5	1.5
膽鹽	0	0.2	0.2	0.2
混合礦物鹽	3	3	3	3
混合維生素	1	1	1	1
DL-蛋氨酸	0.3	0.3	0.3	0.3
氯化膽堿	0.2	0.2	0.2	0.2
粳米	0	0	27.65	0
面粉（標準粉）	0	0	27.65	0
粗雜糧	0	0	0	55.3
供能（Kcal）	303	339	323	337

注：各組飼料能量差異不超過(guò)四組平均值的10％；

陰性對照組供能比：蛋白質(zhì)4.1%，脂肪20.8%，碳水化合物75.1%；

高脂對照組供能比：蛋白質(zhì)4.7%，脂肪34.0%，碳水化合物61.3%；

米面組供能比：蛋白質(zhì)11.0%，脂肪37.3%，碳水化合物51.7%；

粗雜糧組供能比：蛋白質(zhì)13.0%，脂肪39.5%，碳水化合物47.5%。

1.1.3實(shí)驗動(dòng)物  體重200g～220g清潔級近交系雄性Sprague-Dawlay (SD)大鼠40只，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗動(dòng)物中心，許可證號：SCXK（滬）2003－0003。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗動(dòng)物分組及造模  40只SD大鼠按體重隨機分成陰性對照組10只，給予陰性對照組飼料，高脂造模組30只，給予高脂飼料。兩組大鼠在第6周末禁食12～14小時(shí)后斷尾采血，測空腹血糖（FBG）和胰島素（INS），計算胰島素抵抗（HOMA-IR）水平。高脂造模組按HOMA-IR隨機分為高脂對照組、米面組、粗雜糧組，每組10只，分別給予高脂飼料、米面組飼料和粗雜糧組飼料，繼續喂養9周。

1.2.2 大鼠空腹血糖和胰島素的測定  實(shí)驗第0周末、第6周末和第11周末，各組大鼠在禁食12～14小時(shí)后斷尾采血，測定空腹血糖（FBG）和胰島素（INS），進(jìn)行連續動(dòng)態(tài)觀(guān)察。第15周末實(shí)驗結束時(shí)，動(dòng)物頸椎脫臼處死，股動(dòng)脈取血，測定FBG和INS；迅速分離睪周脂肪和腎周脂肪。

1.2.3 胰島素抵抗（IR）采用穩態(tài)模型評價(jià)（HOMA-IR）：IR＝（INS×FBG）/22.5，式中INS為空腹血漿胰島素濃度，FBG為空腹血糖。

1.2.4 脂肪組織中PPARγ mRNA表達的測定  （1）脂肪組織總RNA提取：按總RNA 提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行操作。

（2）引物的設計：大鼠PPARγ和β-actin（內參照）引物設計參照GeneBank中大鼠目的基因序列自行設計。

PPARγ  Forward：5’-TCC GTG ATG GAA GAC CAC TC-3’

Reverse：5’-CCC TTG CAT CCT TCA CAA GC-3’              332bp

β-actin  Forward：5’- TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT A-3’

Reverse：5’- CAT CGG AAC CGC TCA TTG CCG ATAG-3’      295bp

（3）RT-PCR：逆轉錄反應體系包括：提取的總RNA4μl，5×反應緩沖液4μl，dNTP (10 mmol/L)1μl，Oligo (dT) 1μl，RNA酶抑制劑1μl，逆轉錄酶1μl，其余用無(wú)RNA酶水補充至20μl。反應條件為：30℃10min，42℃60min，99℃5min，4℃5min。PCR反應體系包括：逆轉錄產(chǎn)物1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Taq DNA 聚合酶12.5μl，其余用無(wú)RNA酶水補充至25μl。PCR擴增條件：β-actin為95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；PPARγ為95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳，并與DNA 標準分子比較鑒定之后，在數字成相儀上照相，掃描分析。

1.2.5 數據處理  數據以±s表示，SAS 8.0統計軟件分析數據，采用one-way ANOVA 進(jìn)行顯著(zhù)性檢驗，組間比較采用SNK檢驗，差異顯著(zhù)性設定為P＜0.05。

2 結果

2.1 復配式粗雜糧對大鼠體重的影響

第1周至第6周為造模期。第6周末，高脂模型對照組、米面組和粗雜糧組大鼠體重顯著(zhù)高于陰性對照組（P＜0.05）。第7周至第15周末進(jìn)行干預。至實(shí)驗結束，粗雜糧組大鼠的體重顯著(zhù)低于高脂模型對照組和米面組（P＜0.05），與陰性對照組相比體重無(wú)顯著(zhù)差異（P>0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2  各組間大鼠體重的比較 (g, ±S, n=10)

Table 2 The comparison of body weight of rats in four groups(g, ±S, n=10)

注：（1）與陰性對照組相比P＜0.05； （2） 與高脂模型對照組相比P＜0.05；（3） 與米面組相比P＜0.05

2.2 復配式粗雜糧對大鼠FBG、INS和HOMA-IR的影響

實(shí)驗第6周末即造模結束時(shí)，四組大鼠的FBG未見(jiàn)差異（P＞0.05），但是用來(lái)造模的三組大鼠（高脂模型組、米面組和粗雜糧組）的INS水平明顯高于陰性對照組（P＜0.05）。第15周末，粗雜糧組和米面組大鼠的FBG水平與陰性對照組相比，差異無(wú)統計學(xué)意義，只有高脂模型組的FBG水平顯著(zhù)高于陰性對照組（P＜0.05）；粗雜糧組大鼠的INS水平明顯低于高脂模型組和米面組（P＜0.05），接近陰性對照組。詳見(jiàn)表3。

表3  各組間大鼠空腹血糖(FBG)和血清胰島素(INS)的比較 (±S, n=10)

Table 3 The comparison of fasting blood glucose(FBG) and insulin(INS) of rats in four groups(±S, n=10)

注：（1）與陰性對照組相比P＜0.05；（2）與高脂模型對照組相比P＜0.05；（3）與米面組相比P＜0.05

根據大鼠的FBG和INS計算HOMA-IR。實(shí)驗前，各組大鼠的HOMA-IR水平無(wú)顯著(zhù)性差異（P＞0.05）。實(shí)驗第6周末，用來(lái)造模的三組大鼠HOMA-IR顯著(zhù)高于陰性對照組（P＜0.05），表明經(jīng)6周高脂飼料喂養，胰島素抵抗大鼠造模成功。第15周末，粗雜糧組HOMA-IR水平顯著(zhù)低于高脂模型對照組和米面組（P＜0.05），與陰性對照組相比差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。而米面組HOMA-IR顯著(zhù)低于高脂模型對照組（P＜0.05）但要高于陰性對照組。表明粗雜糧改善胰島素抵抗的效果要優(yōu)于米面。詳見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠血清HOMA-IR動(dòng)態(tài)變化

Figure 1 The dynamic change of HOMA-IR of rats in four groups

2.3 復配式粗雜糧對大鼠脂肪組織PPARγ mRNA表達的影響

粗雜糧組PPARγ mRNA的表達與其他三組比較明顯增加（P＜0.05）。與陰性對照組比較，高脂模型對照組PPARγ mRNA表達明顯增加（P＜0.05）。米面組PPARγ mRNA的表達明顯高于陰性對照組和高脂模型對照組（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2和圖3。

注：H-高脂模型對照組，C-粗雜糧組，R-米面組，N-陰性對照組，M-DNA marker

圖2  各組間大鼠脂肪組織PPAR-γ mRNA表達的比較

3 討論

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR）屬于細胞內核受體超家族成員，存在3種亞型，包括PPARα、PPARβ和PPARγ。PPARγ的表達具有組織特異性，在鼠中PPARγ主要在貯存脂肪的白色和棕色脂肪組織中表達。

本研究發(fā)現，只給予高脂飼料的高脂模型對照組大鼠脂肪組織PPARγ mRNA的表達水平要明顯高于只給予基礎飼料的陰性對照組大鼠，這與國內外相關(guān)研究結果一致^[4,5]，高脂模型對照組PPARγ表達增加的原因可能與高脂飲食使體內脂肪酸含量增高有關(guān)，因為脂肪酸可輕度上調PPARγ的表達^[6]。粗雜糧組大鼠的胰島素抵抗指數（HOMA-IR）顯著(zhù)低于其他三組，而PPARγ的表達要高于其他組，表明粗雜糧能改善大鼠的胰島素抵抗，并且提示粗雜糧改善胰島素抵抗的機制之一可能是通過(guò)上調PPARγ的表達來(lái)實(shí)現的。近年來(lái)研究發(fā)現PPARγ可直接加強脂肪細胞胰島素受體后的信號轉導過(guò)程，從而增強脂肪細胞對胰島素的敏感性^[7]。粗雜糧使發(fā)生胰島素抵抗大鼠的體重下降，改善了大鼠的肥胖程度。而肥胖與胰島素抵抗是密切相關(guān)的，是代謝綜合征、2型糖尿病、心血管疾病、癌癥等疾病的強危險因素，脂肪組織分泌的細胞因子例如TNF-α、IL-1等更是在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色。PPARγ活化后能夠調節脂肪組織中細胞因子的生成，包括TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、TGF-β等，從而抑制脂肪生成，改善胰島素抵抗^[8,9]。

目前對預防和治療胰島素抵抗的研究多集中在降壓藥、降血脂藥、中成藥等藥物治療方面^[10,11,12]，尚未發(fā)現粗雜糧食品對胰島素抵抗改善作用的報道。本文發(fā)現，復配式粗雜糧食品具有良好的改善胰島素抵抗的作用，為預防和治療胰島素抵抗提供了經(jīng)濟方便的飲食治療的物質(zhì)基礎。

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