史銳，王朝旭¹，藍嵐，韓巍，徐小磊，王克波，劉寶圣

 哈爾濱醫科大學(xué)公共衛生學(xué)院營(yíng)養與食品衛生教研室，哈爾濱 150081

 

摘要：目的  研究鐵缺乏對大鼠維生素A（VA）代謝的影響。 方法  44只雄性SD大鼠按體重隨機分為4組，每組11只，Fe和VA正常對照組（Ⅰ組），Fe完全缺乏VA正常組（Ⅱ組），Fe輕度缺乏VA正常組（Ⅲ組），Fe和VA輕度缺乏組（IV組）。喂飼10周后處死，測定血清視黃醇、血清視黃醇結合蛋白(Retinol-binding protein ，RBP)、血紅蛋白(Hb)、血清鐵、血清鐵飽和度、肝臟VA含量，肝臟視黃基酯含量，并用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測各組大鼠肝臟視黃醇結合蛋白（RBP）mRNA的表達。結果  與對照組相比，鐵缺乏可以使血清視黃醇、肝臟VA含量顯著(zhù)降低（P < 0.05），使肝臟視黃基酯與肝臟VA的摩爾比值升高，使RBP含量有降低趨勢，鐵缺乏時(shí)肝臟視黃醇結合蛋白（RBP）mRNA表達顯著(zhù)降低。結論  鐵缺乏可能通過(guò)影響維生素A吸收、儲存、轉運來(lái)影響體內維生素A的營(yíng)養狀況。

關(guān)鍵詞：鐵缺乏，維生素A代謝，大鼠

中圖分類(lèi)號：         文獻標識碼：

 

SHI Rui， WANG Chao-xu¹，LAN Lan，et al. Department of Nutrition and Food Hygiene, College of Public Health, Harbin Medical University (Harbin 150081, China)

Abstract：Objective  To study the effect of iron deficiency on vitamin A (VA) metabolism in rats. Methods  Forty-four male SD rats were divided randomly into four groups according to their body weights and every group included 11 rats. They were normal iron and VA control group (Ⅰgroup), entire iron deficient and normal VA group (Ⅱgroup), slight iron deficient and normal VA group (Ⅲgroup)), slight iron and VA deficient(Ⅳgroup). After they were raised for ten weeks, the rats were sacrificed and the serum VA, retinol-binding protein（RBP）,hemoglobin, serum iron, serum iron saturation, VA in the liver, retinyl ester in the liver were determined. Results iron deficiency decreased serum VA and VA in the liver significantly,and increased molar ratio of hepatic retinyl esters to retinol significantly. VA deficiency decreased the level of retinol-binding protion(RBP) mRNA expression in the liver significantly. Conclusion iron deficiency may affect VA nutritional status by influencing absorption, storage and transportation of VA.

Key words： Iron deficiency; Vitamin A metabolism; rat

缺鐵性貧血(IDA)與維生素A缺乏曾被羅馬營(yíng)養會(huì )議(1992)和中國營(yíng)養改善行動(dòng)計劃(1997)列為重點(diǎn)解決的健康問(wèn)題，研究證實(shí)貧血和維生素A代謝之間存在一定的聯(lián)系和相互作用^[1] 。缺鐵性貧血與維生素A缺乏往往同時(shí)存在，補鐵能更有效地改善機體維生素A營(yíng)養狀況和免疫功能^[2]。本文研究鐵缺乏對大鼠維生素A營(yíng)養狀況的影響及鐵缺乏對大鼠肝臟視黃醇結合蛋白（RBP）mRNA表達的影響，旨在為鐵缺乏如何影響VA的代謝以及為防治鐵和維生素A這兩種營(yíng)養素缺乏提供科學(xué)依據。

1.     1 材料

 維生素A標準品，視黃基酯標準品(美國Sigma公司)；實(shí)驗動(dòng)物（上海斯萊克實(shí)驗動(dòng)物有限責任公司）；血紅蛋白試劑盒、血清鐵試劑盒、血清總鐵結合力試劑盒（南京建成生物工程研究所）；血清視黃醇結合蛋白ELISA試劑盒（美國ADL公司）。mRNA檢測試劑：總RNA提取試劑Trizol（美國Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（美國Promega公司），PCR試劑Easy Taq DNA Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司），引物（美國Promega公司）。

實(shí)驗選用合成飼料，飼料配方參考了美國營(yíng)養學(xué)會(huì )（American institue of nutrition）推薦的AIN-93G ^[3]嚙齒類(lèi)實(shí)驗動(dòng)物合成飼料配方，并對其進(jìn)行適當調整，其中所含營(yíng)養素和能量能保證大鼠生長(cháng)發(fā)育的基本要求，其中混合無(wú)機鹽中不加鐵、混合維生素中不加維生素A，飼料配方見(jiàn)表1。

表1  飼料主要成分構成(g/kg)

Table 1 Composition of purified experimental (g/kg)

玉米    酪蛋白   蔗糖   色拉油   纖維素    混合     混合     L-蛋氨酸    膽堿   

淀粉                                       無(wú)機鹽   維生素

529.5    200     100      70       50       35       10         3        2.5

混合無(wú)機鹽(1000g)含CaCO₃  500.0g;  NaCl  l74.0g;  K₃C₆H₅O₇·H₂O 70.78g; K₂HPO₄ 196.0g;  K₂SO₄  46.6g;  MgO 24.0g;  MnCO₃  0.63g;  ZnCO₃  1.65g; CuCO_3.Cu(OH)₂. H₂O  0.30g;  KIO₃ 10.0mg;  Na₂SeO₃·5H₂O 9.38mg;  H₃BO₃ 81.5mg;  NaF 63.5mg;  NiCO₃ 57.73mg;  LiCl 17.74mg;  (NH₄)₂Mo₄O₁₃.2H₂O 7.95mg;  NH₄VO₃  6.6mg; 加蔗糖至1000g。

混合維生素(1000g): 維生素B₁ 600 mg; 維生素B₂ 600 mg; 維生素B₆ 700 mg; 尼克酸 3000mg; 泛酸 1600mg; 葉酸200 mg ; 維生素B₁₂ 250 mg; 生物素 75mg; 維生素E 5 000 IU;維生素K₂ 75mg; 維生素D₃ 200mg; 加蔗糖至1000g。

清潔級雄性SD大鼠44只，21日齡，在實(shí)驗室適應一周后，按體重隨機分為4組，每組11只。各組飼料中鐵和維生素A水平如下：Ⅰ組 Fe：35mg/kg 飼料，VA ：1200μg/kg飼料；Ⅱ組 Fe：0mg/kg飼料 ，VA： 1200μg/kg飼料；Ⅲ組 Fe ：15mg/kg飼料，VA ：1200μg/kg飼料；Ⅳ組 Fe ：15mg/kg飼料，VA ：120μg/kg飼料。單籠喂養，所有動(dòng)物均自由進(jìn)食及飲用蒸餾水，溫度19～25℃，濕度55% ～65% ，每日光照12 h，每天記錄攝食量，并觀(guān)察動(dòng)物的一般狀態(tài)，每周稱(chēng)體重1次，實(shí)驗期為10周。實(shí)驗結束后處死動(dòng)物，腹主動(dòng)脈采血，分離肝臟、脾臟。

血清視黃醇、肝臟維生素A、肝臟視黃基酯測定采用高效液相色譜法^[4,5]；血清鐵測定采用比色法；血紅蛋白測定采用氰化高鐵血紅蛋白法；血清視黃醇結合蛋白采用酶聯(lián)免疫吸附法測定。

逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法。取各組動(dòng)物肝臟同一部位，參照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA,并測定RNA濃度。取1μg總RNA逆轉錄合成cDNA第一鏈，取2μl逆轉錄體系的cDNA作為摸板，加引物25pmol、Taq聚合酶0.25μl及相應緩沖液于25μl體系內進(jìn)行PCR擴增，內參照GAPDH。引物序列如下：RBP的上游引物5^'-GGAAGATGCTGAGCAACGAG-3^'，下游引物 5^'-TTGCAGGTCACACCCTCTGC-3^'；內參照GAPDH上游引物5^'-CTCAACTACATGGTCTACATG-3^'，下游引物5^'-TGGCATGGACTGTGGTCATGAG-3^'。PCR條件為94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，RBP和GAPDH循環(huán)35個(gè)周期。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果在凝膠圖象分析系統上掃描，計算RBP產(chǎn)物的密度值與GAPDH的密度值之比。

采用SPSS13.0統計軟件處理數據，結果以均數±標準差(±s )表示，四組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P < 0.05為差異具有統計學(xué)意義。

2.1 各組動(dòng)物體重及攝食量情況(表2)  

各組間的初始體重和終末體重均差異無(wú)統計學(xué)意義（P>0.05），實(shí)驗期內各組動(dòng)物的平均每日攝食量、飼料利用率差異也無(wú)統計學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明本實(shí)驗條件對大鼠體重及攝食量無(wú)不良影響，動(dòng)物生長(cháng)狀況良好。          

表2 各組大鼠體重及攝食量情況比較(±s, n=11，g)

Table 2  The comparison of the rats′weights and food intake in each group(±s, n=11，g)

組別    初始體重      終末體重       體重增長(cháng)     平均每日攝食量  飼料利用率（%）

Ⅰ組  91.55±10.78  320.16±39.46   228.62±35.18   14.72±0.98   27.45±3.83

Ⅱ組  92.07±10.53  323.37±44.55   231.30±40.46   14.77±1.66   28.46±2.11

Ⅲ組  93.12±10.16  344.24±32.76   251.72±34.68   15.80±1.21   28.20±3.21

Ⅳ組  94.01±10.26  337.47±36.70   243.75±34.35   15.35±1.27   28.15±3.08

 

2.2 各組動(dòng)物血清鐵、血紅蛋白（Hb）、血清鐵飽和度(表3) 

Ⅱ組，Ⅲ組，Ⅳ組血清鐵水平顯著(zhù)低于Ⅰ組（P < 0.05），而Ⅱ組，Ⅲ組，Ⅳ組血清鐵水平差異無(wú)統計學(xué)意義（P >0.05）。各組動(dòng)物血紅蛋白，Ⅱ組與Ⅰ組比較，Ⅱ組顯著(zhù)低于Ⅰ組（P < 0.05），Ⅲ組，Ⅳ組較Ⅰ組有下降趨勢，但差異無(wú)統計學(xué)意義（P >0.05）。對于血清鐵飽和度，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組血清鐵飽和度顯著(zhù)低于Ⅰ組（P < 0.05），Ⅱ組，Ⅲ組，Ⅳ組之間差異無(wú)統計學(xué)意義（P >0.05）。可見(jiàn)，鐵缺乏模型建立較成功。

表3 各組大鼠血清鐵、Hb、血清鐵飽和度水平比較(±s, n=11)

Table 3  The comparison of the rats′serum iron，Hb，serum iron saturation in each group (±s, n=11)

組別        血清鐵（mg/L）       血紅蛋白 (g/L)     血清鐵飽和度（％）

Ⅰ組        2.45±0.97                      109.88±13.52        65.82±10.82

Ⅱ組        1.16±0.47 ^a                    97.01±15.68 ^a        25.32±12.19^a

Ⅲ組        1.47±0.47 ^a                    100.98±14.41        34.71±8.85 ^a

Ⅳ組        1.57±0.37 ^a                    105.20±8.75         36.49±7.75 ^a

注:a：與Ⅰ組相比，P < 0.05

 

2.3 各組動(dòng)物肝臟維生素A、肝臟視黃基酯、肝臟視黃基酯與肝臟維生素A摩爾比值（表4）  Ⅱ組，Ⅲ組，Ⅳ組肝臟維生素A顯著(zhù)低于Ⅰ組（P < 0.05），Ⅱ組，Ⅲ組之間差異無(wú)統計學(xué)意義（P >0.05）。肝臟視黃基酯，Ⅳ組顯著(zhù)低于Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅲ組（P < 0.05），Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅲ組比較差異無(wú)統計學(xué)意義（P >0.05）。Ⅱ組，Ⅲ組肝臟視黃基酯與肝臟維生素A摩爾比值顯著(zhù)高于Ⅰ組（P < 0.05）。

 

表4各組大鼠肝臟VA、肝臟視黃基酯、肝臟視黃基酯與VA摩爾比值水平比較(±s, n=11)

Table 4 The comparison of the rats′VA， retinyl ester，molar ratio of hepatic retinyl esters to retinol in the liver in each group (±s, n=11)

組別      肝臟VA （mg/kg）    肝臟視黃基酯（mg/kg）   肝臟視黃基酯與VA摩爾比值               Ⅰ組      23.57±3.28          47.68±11.64               1.34±0.62

Ⅱ組      14.53±3.84^a                42.46±18.04               4.59±5.96^a

Ⅲ組      16.99±4.60^a         49.96±26.01              6.43±4.10^a

Ⅳ組      0.41±0.096^abc               0.79±0.15^abc                        1.14±0.42^bc

注:與Ⅰ組相比，a P < 0.05 ；與Ⅱ組相比，b P < 0.05 ；與Ⅲ組相比，c P < 0.05

 

Ⅱ組血清視黃醇顯著(zhù)低于Ⅰ組（P < 0.05），Ⅳ組與Ⅰ組、Ⅱ組，Ⅲ組之間差異有統計學(xué)意義（P< 0.05）。血清視黃醇結合蛋白，Ⅳ組與Ⅰ組、Ⅱ組，Ⅲ組比較差異有統計學(xué)意義（P <  0.05），Ⅱ組，Ⅲ組與Ⅰ組相比較差異無(wú)統計學(xué)意義（P >0.05），但有下降趨勢。可見(jiàn)，鐵缺乏可以降低血清視黃醇水平，有使血清視黃醇結合蛋白水平降低的趨勢。

 

 

表5各組大鼠血清視黃醇、血清視黃醇結合蛋白水平比較(±s, n=11)

Table 5  The comparison of the rats′serum VA, retinol-binding protein in each group (±s, n=11)

組別        血清VA（μg/L）         血清視黃醇結合蛋白（μg/L）              

Ⅰ組          253.58±36.70             230.05±9.73

Ⅱ組          214.40±49.91^a                       174.12±12.17

Ⅲ組          237.33±45.21             198.96±14.31

Ⅳ組          145.47±58.10^abc                       63.94±6.20^abc

注:與Ⅰ組相比，a P < 0.05 ；與Ⅱ組相比，b P < 0.05 ；與Ⅲ組相比，c P < 0.05

 Ⅰ組視黃醇結合蛋白mRNA的表達最強，同時(shí)從Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組可以看出，視黃醇結合蛋白mRNA表達隨著(zhù)鐵缺乏而減弱。可見(jiàn)，鐵缺乏可以使大鼠肝臟視黃醇結合蛋白mRNA的表達減弱。

圖1 大鼠肝臟視黃醇結合蛋白mRNA的表達

Figure 1 RBP mRNA expression levels in different group

鐵缺乏與維生素A缺乏是兩大主要的營(yíng)養素缺乏，這兩種營(yíng)養素缺乏往往同時(shí)發(fā)生，二者的發(fā)生均與社會(huì )經(jīng)濟因素有一定關(guān)系，但當去除社會(huì )經(jīng)濟的影響后，二者仍表現出顯著(zhù)的相關(guān)性^[6]。所以研究鐵與維生素A在貧血中的相互作用對于改善世界各國尤其是發(fā)展中國家鐵缺乏和維生素A缺乏的狀況是十分有益的。

目前認為鐵缺乏影響維生素A代謝可能的機制是：鐵缺乏導致貧血，由于自身的保護機制，使肝臟中維生素A的儲存形式增加，貧血的進(jìn)一步發(fā)展，使維生素A在肝臟中的代謝受到破壞，從而使血清視黃醇減少^[7]。

正常情況下，大鼠肝臟中儲備一定量的鐵，因此鐵缺乏到鐵嚴重缺乏是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，本實(shí)驗中鐵缺乏沒(méi)有對大鼠體重和攝食量產(chǎn)生影響，這可能是鐵還沒(méi)有達到嚴重缺乏的程度，鐵缺乏時(shí)并不是首先影響體重和生長(cháng)。鐵缺乏引起血清視黃醇、肝臟視黃醇含量下降，血清視黃醇結合蛋白有降低趨勢，肝臟視黃基酯與視黃醇摩爾比值升高，提示鐵缺乏可通過(guò)影響維生素A吸收、儲存、轉運來(lái)影響體內維生素A的營(yíng)養狀況，原因可能是鐵缺乏使肝臟視黃基酯的水解反應減少或者是增加了肝臟視黃醇的酯化反應，導致肝臟中視黃醇和視黃基酯的平衡被打破，從而使得可供機體利用的維生素A的活性物質(zhì)視黃醇減少，而儲存形式視黃基酯增加。

在視黃醇轉運中，視黃醇結合蛋白是轉運視黃醇從肝臟到周?chē)M織的運轉工具^[8]；在血漿轉運視黃醇過(guò)程中，RBP防止其醇羥基被氧化，從而增加其在轉運過(guò)程中的穩定性，同時(shí)對視黃醇的釋放起調節作用^[9]。本實(shí)驗中，鐵缺乏使得血清視黃醇結合蛋白含量有減少趨勢，肝臟視黃醇結合蛋白 mRNA的表達減弱，降低了視黃醇結合蛋白的合成，視黃醇結合蛋白合成減少后，吸收入小腸上皮細胞的視黃醇不能有效的轉運至體內，儲存形式的視黃醇也不能有效地動(dòng)用，需視黃醇組織不能得到充分的視黃醇進(jìn)行生物合成。總之，鐵可能促進(jìn)維生素A的吸收和轉運，對于改善維生素A的營(yíng)養狀況具有良好的作用，這些作用與鐵能促進(jìn)視黃醇結合蛋白合成有關(guān)。

 視黃醇結合蛋白是維生素A的特異性運載蛋白，它在介導維生素A及其代謝物生理功能的正常發(fā)揮中具有不可替代的重要作用。鐵缺乏對RBP影響的研究對于深入了解機體對維生素A的攝取，利用的分子機制，揭開(kāi)了新的一頁(yè)。而鐵缺乏對視黃醇結合蛋白基因影響的研究，更將其功能由運載蛋白拓展到基因分子層面，在缺鐵性貧血中，RBP的作用機制如何，將是今后一個(gè)研究熱點(diǎn)。

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