2型糖尿病患者血液3-硝基酪氨酸檢測及其相關(guān)因素分析

王勃詩(shī) 劉英華 徐慶 王覲 于曉明 郭長(cháng)江¹ 薛長(cháng)勇²

解放軍總醫院營(yíng)養科，北京100853 ¹

摘要：目的 觀(guān)察2型糖尿病患者血清3-硝基酪氨酸水平及其相關(guān)因素分析。方法 按隨機病例對照研究方法，招募確診的2型糖尿病患者109例，非糖尿病對照病例57例。對研究對象進(jìn)行人體測量、血生化指標檢測和血清3-硝基酪氨酸（3-NT）水平測定，并分析3-NT的相關(guān)因素。結果 兩組入選受試者的年齡、體重等指標均無(wú)顯著(zhù)性差異；糖尿病組血糖、糖化血清蛋白、總膽固醇、載脂蛋白C₂（Apo C₂）明顯高于非糖尿病對照組(P<0.05)。糖尿病組3-NT水平明顯高于非糖尿病對照組，且糖尿病組男性高于非糖尿病對照組男性、糖尿病組女性高于非糖尿病對照組女性(P<0.05)；BMI>28kg/m²糖尿病患者3-NT明顯高于BMI<24 kg/m²糖尿病患者；空腹血糖＞6.1mmol/L糖尿病患者3-NT水平也高于空腹血糖≤6.1mmol/L糖尿病患者(P<0.05)；糖尿病組回歸分析顯示與3-NT線(xiàn)性相關(guān)性最大的因素依次為糖化血紅蛋白、糖化血清蛋白、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。結論 糖尿病患者3-NT水平明顯高于非糖尿病對照人群；3-NT水平與糖化血紅蛋白、糖化血清蛋白、LDL-C等因素密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：2型糖尿病；3-硝基酪氨酸；糖化血紅蛋白；糖化血清蛋白；LDL-C

The investigation to the levels of 3-nitrotyrosine and its correlation factors in type 2 diabetic patients

wang Bo-shi^1,2，LIU Ying-hua ¹，XU Qing¹，WANG Jin¹，YU Xiao-ming¹，GUO Chang-jiang²，XUE Chang-yong¹﹡

（¹Department of Nutrition, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853,China

²Institute of Hygiene and Environmental Medicine, Tianjin 300050,China）

【Abstract】 Objective To investigate levels of 3-nitrotyrosine, the end-product of nitrated proteins and its correlation factors in type 2 diabetic patients. Methods A randomized

case-control trial was carried out, in which 109 type 2 diabetic patients and 57 non-diabetics were enrolled. Anthropometric measurements, blood biochemical variables and 3-nitrotyrosine (3-NT) were measured. Results There are no significant differences between two groups in age, body weight. However, blood glucose, glucosylated serum protein (GSP), total cholesterol, apolipoproteinC2 in diabetic patient group were much higher than those in control group (p<0.05). 3-NT in blood was much higher in diabetic group than in non-diabetic group, and 3-NT was higher in both male and female diabetic subjects than in non-diabetic male and female subjects, respectively(p<0.05). In diabetic group, subjects with BMI>28kg/m² had higher 3-NT level than those with BMI<24kg/m². 3-NT in subjects with blood glucose greater than 6.1mmol/L was higher in those with glucose≤6.1mmol/L(p<0.05). The results of regression analysis in the

diabetic group showed that glucosylated hemoglobin (HbA1c), GSP, low density lipoprotein cholesterol（LDL-c）were the most correlated to 3-NT in blood. Conclusion Levels of 3-NT was increased more in diabetic group than in non-diabetic group. 3-NT was closely correlated to HbA1c, GSP, and LDL-c in diabetic patients.

Key words: type 2 diabetes; 3-nitrotyrosine; glycosylated hemoglobin; glucosylated serum protein; LDL-c

酪氨酸硝基化是指蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基被硝基化成3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）。酪氨酸硝基化作為一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在病理狀態(tài)下伴隨活性氧和活性氮的增加而產(chǎn)生。近年來(lái)在許多疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、缺血－再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病、器官移植排斥等病變的相應組織蛋白中都可以檢測到3-NT的存在^{[1, 2]}。但是2型糖尿病患者蛋白質(zhì)硝基化程度如何及其在糖尿病并發(fā)癥中的作用沒(méi)有確切的定論。本研究以2型糖尿病患者和非糖尿病患者為研究對象，觀(guān)察兩組人群血清3-NT水平的差異及其相關(guān)因素，為探討抗硝基化干預和治療糖尿病進(jìn)而防止其并發(fā)癥提供基礎研究依據。

1材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 2型糖尿病組 篩選2007年3月～2007年9月在中國人民解放軍總醫院門(mén)診確診的2型糖尿病患者，以及社區招募到的2型糖尿病患者109例（男44例，女65例），年齡45～77歲，平均（60.14±7.12）歲。糖尿病診斷標準為空腹血漿葡萄糖≥7.0mmol/L或75g葡萄糖OGTT測定2小時(shí)血漿葡萄糖≥11.1mmol/L。其他條件包括：①年齡≥45周歲，漢族；②體質(zhì)指數（BMI）≥18.5 kg/m²；③無(wú)嚴重肝、腎、胃病以及心血管等疾病，無(wú)急性和慢性感染性疾病，無(wú)糖尿病酮癥酸中毒；④自愿參加本研究，并簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 對照組 為社區招募到的健康體檢者57例（男42例，女15例），年齡35～73歲，平均（58.36±7.96）歲。明確排除2型糖尿病，一級親屬中無(wú)2型糖尿病患者。

1.2 研究方法

1.2.1 分組和觀(guān)察指標 隨機病例對照研究。將入選人群進(jìn)行人體測量、血生化檢測和血清3-NT水平的測定。人體測量指標包括身高、體重、BMI等；血生化指標包括空腹血糖、糖化血清蛋白、糖化血紅蛋白、血漿胰島素、血膽固醇、血甘油三酯和載脂蛋白。

1.2.2人體測量 人體測量采用TZ-1型身高體重秤和中體同方體育科技有限公司生產(chǎn)的BCA-2A人體成份分析儀測定。空腹血生化指標采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀。

1.3 3-NT檢測：3-NT濃度檢測采用ELISA試劑盒（ Hycult biotechnology bv， Lot#:5822k19），該試劑盒的檢測范圍是2~1500nmol/L。樣本均為新鮮血清，稀釋25倍。每個(gè)樣品均設平行樣，用酶標儀測量450nm吸收光值（A值）。

1.4統計方法：結果用均數±標準差表示，數據統計采用SPSS 13.0進(jìn)行。兩組之間比較采用t檢驗，單因素多水平資料采用方差分析，相關(guān)分析采用多元線(xiàn)性逐步回歸方法。

2結果

2.1兩組受試者一般情況

由于非糖尿病人群中符合入選標準的女性受試者較難募集，導致兩組間身高和BMI有顯著(zhù)性差異，但是年齡、體重、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、Apo B、Apo C₃等指標在糖尿病組和非糖尿病對照組間均無(wú)差異。糖尿病組的血糖、糖化血清蛋白、總膽固醇指標均高于非糖尿病組，糖尿病組血胰島素水平低于非糖尿病組；糖尿病組女性apo A₁較對照組女性高（表1）。

表1 受試者一般情況與血液生化

Table 1 Basic characteristics in diabetic and non-diabetic group

組別	年齡 （歲）	身高 (cm)	體重 （kg）	BMI (kg/m2)	葡萄糖(mmol/L)	糖化血清蛋白(μmol/L)
糖尿病組	60.14±7.12	161.70±6.20(1)	65.17±8.00	24.88±2.44(1)	7.94±2.33(1)	244.37±63.08(1)
男	60.02±8.61	168.40±4.52	70.17±7.35	24.74±2.41	7.98±2.34	249.30±68.39
女	60.22±6.10	157.16±3.47	61.78±7.04	24.96±2.47	7.91±2.33	241.02±59.20
對照組	58.36±7.96	169.07±5.69	67.42±7.11	23.54±1.84	4.79±0.62	198.36±42.05
男	58.75±8.35	171.64±4.51	69.24±6.81	23.45±1.84	4.72±0.63	200.17±44.45
女	57.33±6.98	161.87±4.79	62.33±6.22	23.78±1.84	4.88±0.54	192.07±37.02
組別	糖化血紅蛋白(%)	胰島素 (mU/ml)	總膽固醇 (mmol/L)	甘油三酯 (mmol/L)	HDL-C (mmol/L)	LDL-C (mmol/L)
糖尿病組	7.37±1.18	10.18±5.86(1)	5.36±0.77(1)	1.66±0.74	1.43±0.30	2.74±0.53
男	7.30±1.17	8.04±3.59	5.15±0.66	1.38±0.45	1.33±0.28	2.73±0.50
女	7.42±1.18	11.11±7.18	5.47±0.78	1.82±0.90	1.48±0.31	2.75±0.55
對照組	——	31.82±14.12	4.67±0.54	1.20±0.28	1.33±0.24	2.62±0.47
男	——	34.58±16.65	4.71±0.52	1.17±0.27	1.29±0.24	2.55±0.50
女	——	23.55±10.01	4.58±0.68	1.24±0.28	1.45±0.23	2.79±0.39
組別	Apo A1 (mmol/L)	Apo B (mmol/L)	Apo C2 (mg/dl)	Apo C3 (mg/dl)	Apo E (mg/dl)	Apo AⅡ (mg/dl)
糖尿病組	1.47±0.20	1.13±0.20	3.29±1.5	10.02±2.78	5.56±1.4	29.67±3.38
男	1.40±0.18	1.11±0.16	2.85±0.86	9.37±2.08	5.06±1.15	30.04±3.25
女	1.51±0.19(1)	1.14±0.22	3.53±1.89	10.37±3.12	5.83±1.48	29.47±3.48
對照組	1.27±0.21	1.06±0.19	3.44±1.02	10.01±2.15	——	——
男	1.28±0.22	1.05±0.18	3.47±1.01	9.99±2.02	——	——
女	1.25±0.22	1.09±0.21	3.29±1.06	10.54±2.50	——	——

注：(1)  與對照組進(jìn)行t檢驗 P<0.05。

2.2 3-硝基酪氨酸：由測得的標準液A值與已知的標準液濃度得到以下標準曲線(xiàn)（圖1）。

進(jìn)而由樣本OD值得到樣本的3-NT濃度：糖尿病組血液中3-NT明顯高于非糖尿病對照組[115.41±8.30 v.s.( 95.83±6.89) nmol/L,P<0.05]。按性別分層后，糖尿病組男性和女性血液中3-NT水平均顯著(zhù)高于其相應的對照組。不論糖尿病組還是對照組，男性和女性組之間血液中3-NT水平均沒(méi)有顯著(zhù)性差異（表2）。

表2糖尿病患者和非糖尿病患者血液中3-NT水平

Table 2 The levels of 3-NT in diabetic and non-diabetic group

指標	糖尿病組		非糖尿病對照組
	男（n=44）	女（n=65）	男（n=42）	女（n=15）
3-NT（nmol/L）	115.03±7.16(1)	115.67±9.11(1)	96.01±6.34	95.31±8.46

注：(1)  與對照組進(jìn)行t檢驗 P<0.05。

2.3糖尿病患者分層處理后血液中3-NT水平：結果見(jiàn)表3。

表3糖尿病患者不同BMI、空腹血糖、年齡、病程中的3-NT水平

Table 3 The levels of 3-NT in diabetics with different BMI, blood glucose, ages and diabetic courses

注：(1)  與對照組進(jìn)行t檢驗 P<0.05

按BMI分層：BMI>28kg/m²組3-NT水平明顯高于BMI<24kg/m²組（表3），同時(shí)可見(jiàn)隨著(zhù)BMI的增加，血液3-NT水平有逐漸增高的趨勢。并且空腹血糖＞6.1mmol/L糖尿病患者3-NT水平高于血糖≤6.1mmol/L糖尿病患者。

將糖尿病組按年齡≤60歲和年齡＞60歲分層，3-NT水平在這兩組間無(wú)顯著(zhù)差異（P>0.05，表3）。將糖尿病組按病程≤5年、病程＞5年分層，3-NT水平在兩組間無(wú)顯著(zhù)差異（P>0.05，表3）。

2.4 逐步回歸分析：以年齡、身高、體重、BMI、空腹血糖、糖化血清蛋白、糖化血紅蛋白、胰島素、總膽固醇、甘油三酯、HDL-C、LDL-C、Apo A₁、Apo B、Apo C₂、Apo AⅡ、Apo C₃等因素為自變量，以3-NT值為因變量，對全部糖尿病患者進(jìn)行逐步回歸分析，變量引入和剔除的標準分別為0.05、0.10^[3]。經(jīng)逐步擬合，有三個(gè)自變量入選方程，3-NT與LDL-C、糖化血清蛋白、糖化血紅蛋白有線(xiàn)性回歸關(guān)系，“最優(yōu)”回歸方程為Y=104.12+5.03X₁-3.34X₂-0.06X₃。由標準化回歸系數看出，糖化血紅蛋白Beta值最高，即對3-NT影響最大（表4）。決定系數R²=0.247說(shuō)明3-NT能被LDL-C、糖化血清蛋白、糖化血紅蛋白解釋的比例為24.7%。對回歸方程進(jìn)行方差分析，F=7.22，P=0.00。其他因素的偏回歸系數經(jīng)t檢驗，P＞0.10，均被剔除，即與3-NT沒(méi)有線(xiàn)性相關(guān)(表4)。

表4 糖尿病患者血液3-NT逐步回歸分析

Table 4 The results of regression analysis in the diabetic group

3 討論

蛋白質(zhì)硝基化普遍存在于糖尿病及其心血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展階段^{[1, 2]}。在過(guò)氧化損傷中總是伴隨著(zhù)活性氧物質(zhì)如NO的增多，NO與O^– 反應生成過(guò)氧亞硝酸鹽（ONOO^–），ONOO^–是一種強氧化劑，可使蛋白質(zhì)酪氨酸殘基發(fā)生硝基化，最終形成3-NT^[4]。作為過(guò)氧化損傷的終產(chǎn)物之一，3-NT在糖尿病患者和非糖尿病正常人體內的血漿含量是否有差別，其含量與血糖、糖化血紅蛋白、血脂指標之間的關(guān)系等一系列問(wèn)題均沒(méi)有確切的定論。

有研究表明用高濃度血糖灌注離體心臟，將明顯地升高冠狀動(dòng)脈灌注壓并伴隨著(zhù)3-NT的生成^[5]；在2型糖尿病患者的血液中，硝基化載脂蛋白A -I（apolipoprotein A -I，Apo A -I）含量明顯增高，比正常同齡對照高50%^[6]，而Apo A-I 的硝基化與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切。這些結果無(wú)疑對探索糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制有著(zhù)積極的意義。

本研究采用ELISA方法對人體血清3-NT進(jìn)行定量測定，發(fā)現糖尿病患者血清3-NT水平明顯高于正常人[115.41±8.30 v.s. (95.83±6.89 )nmol/L,P<0.05]。Frost在堿性條件下水解血漿蛋白測得正常人血漿中3-NT為(14±0.7)ng/ml，檢測限為100pg^[7]。有研究用HPLC法測得墨西哥糖尿病人（n=40）血漿游離3-NT值為11.0±1.7nmol/L，非糖尿病人（n=40）為(10.4±1.5)nmol/L，兩組間3-NT沒(méi)有顯著(zhù)差異^[8]。也有研究發(fā)現1型糖尿病患者血紅蛋白中的3-NT水平是降低的^[9]。國內有研究用ELISA方法測得70例正常中國人的血漿3-NT為(7.5±5.3)nmol/L^[10]；糖尿病人血漿3-NT為(0.251±0.141)mmol/L^[2]。由于檢測方法和樣本量受限，導致結果不一致。本研究采用的ELISA方法最低檢測限為2nM，檢測的樣本量較大，證實(shí)了糖尿病患者體內存在著(zhù)蛋白質(zhì)硝基化的損傷過(guò)程。

本研究還發(fā)現肥胖和空腹血糖高的糖尿病患者3-NT較高，這可能是因為高血糖總是伴隨和導致過(guò)氧化損傷^[11]，而血糖高的糖尿病患者總熱量一般控制不好，這同時(shí)也是導致肥胖的一個(gè)重要因素。Antonio等發(fā)現在2型糖尿病人群中，血漿中的硝基酪氨酸水平與血糖濃度呈正相關(guān)，餐后高血糖現象也與酪氨酸硝基化現象相伴隨出現^[2]。而用普蘭林肽治療1型糖尿病患者，在降低餐后血糖的同時(shí)也明顯地降低了3-NT的含量^[12]。本研究結果結合這些先期研究提示：在糖尿病治療中，通過(guò)合理飲食和藥物治療控制血糖、保持正常體重，可以減少蛋白質(zhì)硝基化修飾。

按年齡和病程分層分析糖尿病患者3-NT數據，沒(méi)有發(fā)現顯著(zhù)差異，可能是因為樣本量小。以往研究發(fā)現3-NT在女性糖尿病患者血漿中明顯高于男性糖尿病患者^[8]，但是本研究糖尿病組內男女之間3-NT沒(méi)有顯著(zhù)差異，這有待增加樣本量進(jìn)行進(jìn)一步測定。回歸分析發(fā)現3-NT水平與糖化血紅蛋白、糖化血清蛋白呈線(xiàn)性相關(guān)，且與糖尿病心血管并發(fā)癥危險因素LDL-c呈線(xiàn)性負相關(guān)。

3-NT的血清水平在糖尿病患者體內明顯高于正常人，3-NT水平與血糖、BMI、糖化血紅蛋白、糖化血清蛋白、LDL等因素密切相關(guān)。至此，可以認為蛋白質(zhì)硝基化是糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的重要危險因素之一。如果通過(guò)進(jìn)一步研究，對糖尿病患者進(jìn)行科學(xué)合理的膳食干預，找到能夠降低3-NT水平的食物種類(lèi)和消費頻次，那么對于減少糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生、改善糖尿病的生活質(zhì)量具有重要的臨床和實(shí)踐意義。

參考文獻

1.      Bo S, Gambino R, Guidi S, et al. Plasma nitrotyrosine levels, antioxidant vitamins and hyperglycaemia[J]. Diabet Med, 2005, 22(9):1185-9.

2.      Ceriello A, Mercuri F, Quagliaro L, et al. Detection of nitrotyrosine in the diabetic plasma: evidence of oxidative stress[J]. Diabetologia, 2001, 44(7):834-838.

3.      王樂(lè )三. SPSS在醫學(xué)科研中的應用[M]. 北京-化學(xué)工業(yè)出版社, 2007:143-51.

4.      Mercuri F, Quagliaro L, Ceriello A. Oxidative stress evaluation in diabetes[J]. Diabetes Technol Ther, 2000 , 2(4):589-600.

5.      Ceriello A, Quagliaro L, D'Amico M, et al. Acute hyperglycemia induces nitrotyrosine formation and apoptosis in perfused heart from rat[J]. Diabetes, 2002, 51(4):1076-82.

6.      Hermo R, Mier C, Mazzotta M, et al. Circulating levels of nitrated apolipoprotein A-I are increased in type 2 diabetic patients[J]. Clin Chem Lab Med, 2005, 43(6):601-6.

7.      Frost MT, Halliwell B, Moore KP. Analysis of free and protein-bound nitrotyrosine in human plasma by a gas chromatography/mass spectrometry method that avoids nitration artifacts[J]. Biochem J , 2000 Feb 1, 345 Pt 3:453-8.

8.      Wang XL, Rainwater DL, Leone A, et al. Effects of diabetes on plasma nitrotyrosine levels[J]. Diabet  Med, 2004, 21(6):577-80.

9.      Ahmed N, Babaei-Jadidi R, Howell SK, et al. Degradation products of proteins damaged by glycation, oxidation and nitration in clinical type 1 diabetes[J].Diabetologia, 2005 , 48(8):1590-603.

10.    Sun YC, Chang PY, Tsao KC, et al. Establishment of a sandwich ELISA using commercial antibody for plasma or serum 3-nitrotyrosine (3NT). Elevation in inflammatory diseases and complementary between 3NT and myeloperoxidase[J]. Clinica Chimica Acta; Intern  J Clin  Chem , 2007, 378(1-2):175-80.

11.    Zou MH, Shi C, Cohen RA. High glucose via peroxynitrite causes tyrosine nitration and inactivation of prostacyclin synthase that is associated with thromboxane/prostaglandin H(2) receptor-mediated apoptosis and adhesion molecule expression in cultured human aortic endothelial cells[J]. Diabetes, 2002, 51(1):198-203.

12.    Ceriello A, Lush CW, Darsow T, et al. Pramlintide reduced markers of oxidative stress in the postprandial period in patients with type 2 diabetes[J]. Diabetes Metab Res Rev, 2008, 24(2):103-8.