鐘凱 何慶華 吳永寧[1]

中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所，北京  100021

 

摘要：目的  通過(guò)分析ATCC33222在不同培養環(huán)境下的生長(cháng)曲線(xiàn)和pH值曲線(xiàn)的差異，探討該菌的生長(cháng)規律，并為產(chǎn)生物胺乳酸菌的代謝組學(xué)研究提供合理的采樣策略。方法  配制不同成分、不同pH值的培養基，分別進(jìn)行菌株培養，每1~4小時(shí)取樣一次并測定OD₆₀₀和pH值，獲得生長(cháng)曲線(xiàn)和pH值變化曲線(xiàn)。結果  乳酸菌ATCC33222菌株在不同培養條件下呈現不同的生長(cháng)特性，其中pH3.5和添加殼寡糖的培養基的遲滯期較長(cháng)，添加葡萄糖的培養基指數生長(cháng)期時(shí)間最長(cháng)。MRS培養基、添加葡萄糖的培養基和添加殼寡糖的培養基pH值曲線(xiàn)類(lèi)似，其余3種培養基的pH值曲線(xiàn)各不相同。結論  ATCC33222菌株可能根據生長(cháng)環(huán)境和能量來(lái)源的不同，動(dòng)態(tài)調節不同代謝途徑，以獲得最佳生長(cháng)狀態(tài)。在代謝組學(xué)研究中，培養基pH值推薦使用pH3.5和pH6.5兩種，MRS培養基中可添加氨基酸成分，而葡萄糖成分則不是必須的。pH5.4~5.9可能對乳酸菌有重要意義，代謝組學(xué)研究時(shí)應予以關(guān)注。

關(guān)鍵詞：乳酸菌  代謝組學(xué)  采樣

中圖分類(lèi)號：                        文獻標識碼：A

 

ZHONG Kai, HE Qinghua, WU Yongning

Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050,China

 

Abstract Objectives: sampling strategy for metabolomic studies of ATCC33222 was discussed according to its grown patterns under six different media. Methods: six media with different ingredients or pH value were prepared and ATCC33222 strain cultures were harvested from each medium. Culture samples were collected every 1-4 hours and OD₆₀₀ and pH values were determined thereafter. Growth curves and pH curves were constructed according to these data. Results: Growth curves were different between ATCC33222 strain cultures. MRS+aa pH3.5 and MRS+aa+COS media showed longer lag phase, medium with additional glucose had the longest log phase, MRS+aa under pH6.5 and 5.0 media showed shorter stationary phase. MRS, MRS+aa+glucose and MRS+aa+COS had similar pH curves while the other three pH curves were different from each other. Conclusions: ATCC33222 strain may have the ability of dynamic metabolic regulation to accommodate different culture environment or energy source. In metabolomic studies, pH3.5 and pH6.5 were recommend for culture condition. Amino acids could be used as ingredient in MRS while glucose was only optional. pH5.4-5.9 could be important for lactic acid bacteria metabolomic studies.

Key words: lactobacillus  metabolomics  sampling

 

乳酸菌廣泛存在與自然界，是一種常用的工業(yè)用菌，在乳制品、發(fā)酵食品、酒類(lèi)、青貯飼料中的應用非常廣泛。乳酸菌發(fā)酵可賦予食品特殊風(fēng)味和質(zhì)地，但某些乳酸菌產(chǎn)生的生物胺不僅影響產(chǎn)品品質(zhì)，還可能對人或畜禽的健康產(chǎn)生負面影響^[1~4]，因此其產(chǎn)生物胺的機理以及采取何種工藝措施控制乳酸菌生長(cháng)與代謝成為很多研究者關(guān)注的問(wèn)題。由于A(yíng)TCC33222菌株具有3種脫羧酶活性，因此常被用于乳酸菌產(chǎn)生物胺的機理研究，在基因組和蛋白組學(xué)層面已有相關(guān)探索，但尚未進(jìn)行代謝組學(xué)研究。本文研究了該菌株不同培養條件下生長(cháng)特性的差異，探討了乳酸菌代謝組學(xué)研究的采樣策略，為后續的組學(xué)研究提供了一定的參考依據。

 

乳酸桿菌屬30a菌株（Lactobacillus sp. 30a，ATCC33222，分離自馬胃）為產(chǎn)生物胺的模式菌株，已知其能產(chǎn)生組胺、尸胺和腐胺^[5,6]。

培養基1（MRS pH6.5）為MRS培養基，以52g/L濃度將MRS干粉溶解于蒸餾水中，調節pH值為6.5。培養基2（MRS+aa pH6.5）為MRS培養基中添加10g/L的組氨酸、賴(lài)氨酸和鳥(niǎo)氨酸以及1g/L的酪氨酸，調節pH值為6.5。培養基3（MRS+aa+glu pH6.5）為培養基2中添加20g/L的葡萄糖，調節pH值為6.5。培養基4（MRS+aa pH3.5）和5（MRS+aa pH5.0）分別為培養基2調節pH值為3.5和5.0。培養基6（MRS+aa+COS pH6.5）為培養基2中添加0.5g/L的殼寡糖（COS），調節pH值為6.5。調節pH值的試劑為1mol/L氫氧化鈉和1mol/L鹽酸，以上所有培養基均在121℃，高壓滅菌15min備用。

MRS肉湯培養基（英國OXOID），組氨酸（美國Sigma），賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸、酪氨酸、殼寡糖和葡萄糖等（上海生工）。

全自動(dòng)預真空高壓滅菌鍋（西班牙SELECTA CJ.P.SELECTA）；低溫培養箱（德國MMM）；酸度計（意大利HANNA）；分光光度計（德國Eppendorf）；生物安全柜（美國LABCONCO）；分析天平（德國Sartorius）；BX51顯微鏡（日本OLYMPUS）；漩渦振蕩器（江蘇其林貝爾）；全自動(dòng)回旋接種儀（英國DON whitley）。

ATCC33222菌株在MRS平板培養基上復蘇，挑取單菌落接種至MRS肉湯培養基，之后每12h接種一次，連續接種2次后擴大培養作為種子液。種子液測定600nm吸光度值，并經(jīng)螺旋涂布計數確定種子液濃度，再按照10⁶CFU/ml的接種量分別接種于100ml上述6種培養基，混勻并分裝在10ml試管，每管5ml，每種培養基共計20管，置于37℃靜置培養，每1~4h取1管置于4℃冰箱作為生長(cháng)曲線(xiàn)的采樣點(diǎn)（具體時(shí)間點(diǎn)見(jiàn)圖表），培養結束后一起測定吸光度值（OD₆₀₀）和pH值。測定吸光度值時(shí)均以PBS為空白對照，樣品濃度較大的可用PBS稀釋后測定，結果乘以稀釋倍數作為吸光度值。

在Microsoft Excel 2003中以時(shí)間為X軸，吸光度值和pH值為Y軸作圖（雙Y軸）。以生長(cháng)曲線(xiàn)中相鄰兩點(diǎn)連線(xiàn)的斜率表征較晚時(shí)間點(diǎn)細菌增殖速度，其中負值表示細菌衰亡。

 

不同培養條件下的生長(cháng)曲線(xiàn)和pH值曲線(xiàn)的相互關(guān)系如圖1所示，ATCC33222呈現出不同的生長(cháng)模式，pH值曲線(xiàn)表現出明顯差異。

 

 

 

6種培養基下ATCC33222生長(cháng)曲線(xiàn)特征如表1所示，其中各生長(cháng)階段的時(shí)間點(diǎn)根據生長(cháng)曲線(xiàn)判斷。

培養基	遲滯期 時(shí)間(h)	指數期 時(shí)間(h)	靜止期 起點(diǎn)(h)	衰亡期 起點(diǎn)(h)	最大斜率時(shí)間點(diǎn) (h)	OD 峰值	OD峰值 時(shí)間點(diǎn)(h)
1	3	12	15	-	10.5	3.48	27.5
2	3	13.5	16.5	18	12	3.82	18
3	3	28	31	-	12	4.25	34.5
4	13.5	10.5	24	-	19.5	5.76	30.5
5	3	12	15	18	10.5	5.14	18
6	6	14	20	-	18	5.31	32.5

注：“-”表示未出現或無(wú)法確定

從生長(cháng)曲線(xiàn)看，MRS+aa+COS pH6.5的遲滯期明顯延長(cháng)，MRS+aa pH3.5的遲滯期則達到13.5h，而此時(shí)MRS pH6.5、MRS+aa pH6.5和MRS+aa pH5.0已接近靜止期，其余4中培養基遲滯期無(wú)明顯差異。除加糖培養基指數期維持時(shí)間達28小時(shí)，其余培養基均在12小時(shí)左右。MRS+aa pH6.5和MRS+aa pH5.0的靜止期維持時(shí)間較短，其中MRS+aa pH6.5的靜止期僅維持了2小時(shí)左右即進(jìn)入衰亡期，MRS+aa pH5.0維持約7小時(shí)后進(jìn)入衰亡期，其余培養基的時(shí)間終點(diǎn)均出現衰亡期跡象，但由于實(shí)驗時(shí)間未能繼續延長(cháng)因此不能判定衰亡期出現的時(shí)間。從表征生長(cháng)速率看，各培養基從指數期起點(diǎn)到最大生長(cháng)時(shí)間點(diǎn)耗時(shí)大致在6-12小時(shí)，其中MRS+aa pH3.5為6小時(shí)，MRS+aa+COS pH6.5為12小時(shí)。MRS+aa pH6.5和MRS+aa pH5.0出現最大濃度的時(shí)間最早，其余4種培養基無(wú)明顯差異。pH值曲線(xiàn)總體呈現出三種類(lèi)型，MRS pH6.5、MRS+aa+glu pH6.5和MRS+aa+COS pH6.5均為緩慢下降的近似倒“S”形，這三種培養基pH值均為6.5；MRS+aa pH6.5為先降后升；兩種低pH值培養基為先升后降。

 

本研究選取的培養基主要考慮到乳酸菌能量代謝、酸性環(huán)境、氨基酸底物對產(chǎn)生物胺乳酸菌的影響，同時(shí)引入添加殼寡糖的培養基，考察益生素在生物胺代謝中的作用。從生長(cháng)曲線(xiàn)看，MRS+aa pH3.5和MRS+aa+COS pH6.5的遲滯期較長(cháng)說(shuō)明菌株對于低pH值和添加殼寡糖的培養基不適應。國外有研究也表明，低pH值下乳酸菌可能會(huì )采取聚團的方式抵御不良環(huán)境并降低代謝水平^[7]。殼寡糖作為益生素的一種，能被腸道乳酸菌利用并促進(jìn)乳酸菌生長(cháng)或產(chǎn)生有益的生物學(xué)效應^[8,9]。國內一項研究表明殼寡糖能與細胞體內帶有負電荷的細胞質(zhì)結合，擾亂細胞的正常生理活動(dòng)，改變了細胞膜的選擇透過(guò)性，從而抑制嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌生長(cháng)繁殖^[10]，另一研究則認為殼寡糖能促進(jìn)乳酸菌生長(cháng)^[11]。生物效應的這種不一致性提示寡糖等益生素可能是通過(guò)打破固有菌群平衡發(fā)揮效應，而并非單純的促進(jìn)乳酸菌生長(cháng)或抑制雜菌生長(cháng)。MRS+aa pH6.5和MRS+aa pH5.0培養基在靜止期維持的時(shí)間最短，原因很可能是因為菌株消耗氨基酸產(chǎn)生大量生物胺，而高濃度的生物胺使細胞加速死亡。

從pH值曲線(xiàn)看MRS pH6.5培養基缺乏氨基酸底物無(wú)法產(chǎn)生物胺，因此pH值呈單邊下降。MRS+aa pH6.5培養基的pH值先降到5.41然后回升，可能是菌株優(yōu)先利用葡萄糖作為能量來(lái)源，產(chǎn)生大量乳酸使得pH值下降，隨著(zhù)葡萄糖消耗殆盡菌株開(kāi)始利用氨基酸脫羧供能并產(chǎn)生尸胺、腐胺和組胺。MRS+aa pH5.0培養基的pH值先升至5.88后逐步下降，可能是菌株首先利用氨基酸脫羧產(chǎn)生胺類(lèi)物質(zhì)中和培養基的酸性環(huán)境以達到最佳生長(cháng)pH值，這些結果反映出該菌株可能會(huì )根據生長(cháng)需要，動(dòng)態(tài)調整糖酵解途徑和脫羧途徑的比例，但pH值更低的MRS+aa pH3.5培養基為何沒(méi)有很快出現衰亡期還有待探討。不過(guò)pH3.5的培養基的pH值與pH5.0培養基類(lèi)似，先升至5.38然后逐步下降。這有可能提示，pH5.4~5.9對于A(yíng)TCC33222菌株的生物胺代謝通路有著(zhù)特殊意義。

對于代謝組學(xué)研究，理想的狀態(tài)是對所有代謝物的實(shí)時(shí)監控，然而受技術(shù)手段的限制，目前只能對一些特征時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣分析。由于本實(shí)驗中的pH值曲線(xiàn)實(shí)際上是培養基中乳酸等酸性代謝物和生物胺等堿性代謝物相互關(guān)系的表征，因此更應該注意培養過(guò)程中pH值曲線(xiàn)的變化。由圖可見(jiàn)，生長(cháng)曲線(xiàn)的拐點(diǎn)往往也出現pH值的拐點(diǎn)，因此對生長(cháng)曲線(xiàn)拐點(diǎn)采樣是必要的。當然我們應該注意到有些培養條件下兩個(gè)曲線(xiàn)的不同步性，可通過(guò)增加采樣點(diǎn)來(lái)追蹤pH值的拐點(diǎn)。

兩種低pH值培養基的生長(cháng)曲線(xiàn)和pH值曲線(xiàn)的線(xiàn)形相似，只是在時(shí)相上有不同，可只選取其中之一進(jìn)行研究。在不利條件下細菌如何調整到指數生長(cháng)狀態(tài)是值得關(guān)注的，因此在代謝組學(xué)研究中可以采集遲滯期終點(diǎn)的樣本，考慮到pH3.5培養基有明顯的遲滯期，可能更適合代謝組學(xué)分析。添加葡萄糖和氨基酸的培養基從生長(cháng)曲線(xiàn)和pH值曲線(xiàn)看，與MRS培養基線(xiàn)形無(wú)明顯不同而實(shí)驗時(shí)間相應延長(cháng)，因此可以考慮不采用這種培養基。MRS+aa pH6.5培養僅增加了0.5g/L殼寡糖就產(chǎn)生了明顯的生長(cháng)差異，代謝組學(xué)研究中值得關(guān)注。由于生物胺常常是在長(cháng)期儲存的食物中產(chǎn)生，因此可以適當延長(cháng)培養時(shí)間使細菌進(jìn)入衰亡期，模擬營(yíng)養物質(zhì)不足的環(huán)境。除收集培養上清進(jìn)行代謝足跡研究，還可以收集相應時(shí)間點(diǎn)的細胞樣本對胞內代謝物進(jìn)行分析，從而全面了解生物胺的代謝與分布。

研究結果表明，乳酸菌ATCC33222對于不同培養環(huán)境具有一定的適應性調控機制，但這一結果不一定普遍適用。本實(shí)驗的結果為乳酸菌產(chǎn)生物胺的代謝組學(xué)研究提供了采樣策略的參考依據，文中的部分推論也需要通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)。代謝組數據結合生長(cháng)特性則可以對乳酸菌中生物胺產(chǎn)生、分布的機理給出科學(xué)的解釋?zhuān)瑥亩鵀楹侠淼墓に嚳刂铺峁┮罁瑴p少食品中的生物胺污染。

 

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