摘要：目的 探討孕期膳食對子代肥胖和肥胖相關(guān)基因脂肪酸合成酶（FAS）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）表達的影響。方法 將Wistar孕鼠隨機分為2組，分別食用標準飼料和高蛋白質(zhì)飼料。所產(chǎn)雄性子代分別為對照組（CON）和高蛋白組（HP）。交叉哺乳，斷乳后用標準飼料喂養至成年時(shí)，從對照組中隨機抽取一部分大鼠為高脂對照組（HFCON），HFCON與HP組的大鼠均喂飼高脂飼料，高脂誘導肥胖至實(shí)驗結束。分期處死大鼠取材，應用熒光定量PCR法檢測褐色脂肪中FAS及PEPCK mRNA的表達豐度。結果 孕期高蛋白質(zhì)飼料可降低子代斷乳及高脂誘導肥胖后的體重及肥胖率（P<0.05）；HP組褐色脂肪組織中PEPCK mRNA的表達持續低于CON和HFCON組，而FAS mRNA 在誘導肥胖前、后分別低于CON和HFCON組；結論 孕期適當增加蛋白質(zhì)攝入，可通過(guò)程序性降低子代FAS和PEPCK基因的表達，預防子代成年高脂誘導肥胖的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：肥胖  脂肪酸合成酶  磷酸烯醇丙酮酸羧激酶

中圖分類(lèi)號：                   文獻標識碼：A

 

Abstract: Objective  To investigate the effects of maternal nutritional manipulation on fetal mRNA abundance of fatty acid synthetase (FAS)and phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)，and find out an optimal maternal diet and targets for pharmacological prevention and treatment of obesity. Methods  Wistar pregnant rats were fed a standard diet (SD) and a high protein diet (HPD) during pregnancy, respectively. Their male offspring were assigned to two groups of control (CON) and high protein group (HP) in accordance with the diets of their dams. Offspring were cross-fostered and fed with SD after weaning. At adult, some offspring randomly selected from CON group, namely as high fat control (HFCON), HFCON and HP group rats were fed with high–fat diet (HFD) to induce obesity. At different stages, tissue was collected for analyzing abundance of FAS and PEPCK mRNA by fluorescent quantitation PCR. Results  In HP, body weight and obesity rates were decreased after weaning and HFD (P<0.05). The abundance of PEPCK mRNA was persistently decreased in HP, and the abundance of FAS mRNA in HP was down-regulated before and after HFD vs. CON or HFCON. Conclusion  Reasonably increasing the protein intake during pregnancy can, by decreasing the expression of FAS and PEPCK mRNA, prevent offspring from HFD-induced obesity in adult.

Key words: obesity, fatty acid synthetase, phosphoenolpyruvate carboxykinase

 

肥胖是環(huán)境與遺傳因素相互作用的結果。而孕期營(yíng)養是宮內的主要環(huán)境因素，營(yíng)養的改變可以導致組織結構、功能、代謝的改變，并產(chǎn)生“記憶”，持續影響胎兒成年肥胖的形成。因此，孕期飲食較成年飲食與基因的相互作用對肥胖的發(fā)生、發(fā)展具有更重要的意義。隨著(zhù)“代謝程序化”及“營(yíng)養程序化”等理論的提出，生命早期營(yíng)養對成年慢性病影響的研究成為近年研究的熱點(diǎn)。

目前，國際上這方面的研究大多集中在生命早期能量攝入水平或某種營(yíng)養素缺乏上，關(guān)于生命早期不同營(yíng)養素過(guò)量的研究很少。而且許多研究證明高蛋白膳食可以降低體脂含量。針對這種現狀，我們從孕鼠入手，動(dòng)態(tài)觀(guān)察孕期高蛋白飼料對后代體重、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）mRNA表達的影響，探討生命早期不同膳食構成程序性影響肥胖和肥胖相關(guān)基因的機制，為尋找防治肥胖的靶標及合理的孕期膳食提供依據。

 

1.1.1 實(shí)驗動(dòng)物分組  180只SPF級Wistar近交系雌鼠和90只雄鼠（購于上海斯萊克實(shí)驗動(dòng)物有限公司）交配，陰道分泌物涂片鏡檢，共檢出120只孕鼠。于檢出當日，按體重將孕鼠隨機分為2組，分別飼以標準飼料和高蛋白飼料，21天自然分娩。標準飼料和高蛋白飼料孕鼠的雄性后代分別為對照組（CON）和高蛋白質(zhì)組（HP）。為將飲食干預控制在出生前，子鼠均由標準飼料大鼠哺乳3周，斷乳后2組雄鼠均食用標準飼料至出生后第8周，從對照組中隨機抽取一部分大鼠為高脂對照組（HFCON），HFCON與HP組的大鼠均喂飼高脂飼料誘導肥胖至實(shí)驗結束(14周)。大鼠肥胖的判定：實(shí)驗結束時(shí)體重≥實(shí)驗結束時(shí)CON組體重均值+2倍標準差（x+2s）。

1.1.2 指標檢測  分別在大鼠出生、斷乳、高脂誘導肥胖前后各處死1批大鼠，前3個(gè)階段每組各10只大鼠，第4個(gè)階段CON組10只，HP和HFCON組分別30只大鼠。取肩胛間褐色脂肪檢測FAS和PEPCK mRNA的豐度。

1.1.3 指標計算  肥胖率（%）＝每組大鼠肥胖數/該組大鼠總數×100%。基因相對含量=未知基因mRNA濃度/β-actin mRNA濃度。

采用實(shí)驗室合成飼料，各種飼料配方的主要成分見(jiàn)表1。標準飼料配方參考美國農業(yè)部人類(lèi)營(yíng)養研究中心推薦的實(shí)驗動(dòng)物飼料配方AIN-93G配制。添加豬油，減少大豆油和碳水化合物含量配制出高脂飼料，用于成年后飲食誘導肥胖。綜合Lacroix 等^[1]和 Natalie等^[2]的文獻報道，添加干酪素，減少碳水化合物含量，配制出高蛋白飼料。

飼料構成	干酪素	脂肪	碳水化合物	礦物質(zhì)	維生素
標準飼料	20.54	7.00	66.76	3.50	1.00
高蛋白質(zhì)飼料	35.94	7.00	51.35	3.50	1.00
高脂飼料	19.02	18.00	56.78	3.50	1.00

采用熒光定量聚合酶鏈反應（fluorescent quantitation polymerase chain reaction，FQ-PCR）兩步法。在A(yíng)BI Prism 7500 Fast Real-Time PCR System上進(jìn)行PCR擴增。擴增體系20μl。擴增條件：95℃、10s，1個(gè)循環(huán)；95℃、5s，FAS 60℃、30s（PEPCK 58℃，β-actin 54℃），40個(gè)循環(huán)。引物和探針序列見(jiàn)表2。

名稱(chēng)	基因序列	Gene bank
FAS-F FAS-R FAS-P	5’-TCTCTGGTGGTGTCTACATTTCG -3’ 5’- GCAGGATAGCACTCTCAGACAG -3’ 5’-(FAM) ACAACAGCAACCTCACGGCGGCAG (TAMRA)-3’	NM_017332
PEPCK-F PEPCK-R PEPCK-P	5’-GAACTCACTGCTTGGGAAGAAATG -3’ 5' -GGTTAGTTATGCCCAGGATCAGC-3’ 5’-(FAM) TCCGCCAGCCACCCTTCCTCCTT (TAMRA)-3’	NM_198780
β- actin-F β- actin-R β- actin-P	5’-AGGGAAATCGTGCGTGAC -3’ 5’-CGCTCATTGCCGATAGTG -3’ 5’-(FAM)CTGTGCTATGTTGCCCTAGACTTC (TAMRA)-3’	NM_031144

輸入標準品濃度，繪制標準曲線(xiàn)，計算并輸出PEPCK和FAS mRNA濃度。

采用SPSS 13.0統計軟件處理數據，組間均值比較運用方差分析處理，率的比較用X²檢驗處理。

 

如表3所示，各組大鼠出生體重無(wú)差異（P>0.05）。在斷乳和高脂誘導肥胖后，HP組大鼠的體重分別低于CON和HFCON組的體重（P<0.05）；在高脂誘導肥胖后，HP組大鼠的肥胖率較HFCON組明顯降低（P<0.05）。說(shuō)明孕期高蛋白飼料可以降低子代高脂誘導肥胖的發(fā)生。

分組	體重(g)				肥胖率
	1天	3周	8周	14周	（%）
對照組	6.3±0.3	39.0±2.5	180.9±10.0	304.5±6.7	0.00
高脂對照組				325.2±14.0	70.00
高蛋白組	6.0±0.2	36.8±4.1（1）	173.6±13.6	305.9±22.2（2）	33.33(2)

注：（1）與對照組比較P<0.05，（2）與高脂對照組比較P<0.05

由圖1可見(jiàn)大鼠褐色脂肪組織中的FAS基因在出生和斷乳時(shí)表達水平較低，斷乳后攝入標準飼料后FAS mRNA的表達迅速增加。在高脂誘導肥胖前、后，HP組FAS基因的表達分別低于CON和HFCON組，說(shuō)明孕期高蛋白飼料可抑制子代FAS基因的表達，減少脂肪沉積。

 

 

 

由圖2可見(jiàn)從出生到成年高脂誘導肥胖前，HP組大鼠的褐色脂肪組織中PEPCK基因的表達持續低于CON組，高脂誘導肥胖后HP組大鼠的PEPCK基因的表達較HFCON組明顯降低，說(shuō)明孕期高蛋白飼料可持續抑制子代PEPCK基因的表達，從而減少甘油異生和糖異生而降低脂肪積聚。

 

 

 

營(yíng)養素是孕期的主要宮內環(huán)境因素，宮內營(yíng)養會(huì )影響胎兒成年后患肥胖等慢性病的風(fēng)險。有文獻報道孕期不同膳食成分會(huì )影響胎兒的生長(cháng)發(fā)育^[3]。動(dòng)物實(shí)驗證明孕期低蛋白飼料不但可以降低出生體重，而且會(huì )增加日后體脂的沉積^[4]。但孕期高蛋白飼料對子代的作用尚有爭議。ZHANG等報道孕期和哺乳期食用高蛋白飼料可以降低成年雌性后代肝臟TG的含量^[5]。本課題中HP組的大鼠在斷乳時(shí)和高脂誘導肥胖后的體重及肥胖率均低于對照組的大鼠。說(shuō)明孕期高蛋白飼料可以影響胎兒的代謝，并持續影響成年后肥胖的發(fā)生。這進(jìn)一步說(shuō)明生命早期營(yíng)養干預具有重要的意義。

許多研究證實(shí)膳食因素可直接或間接調節基因表達^[6,7]。FAS是脂肪從頭合成的關(guān)鍵酶，是體內調節能量消耗和儲存的重要位點(diǎn)之一。GIRARD等研究發(fā)現，哺乳期間小鼠脂肪組織內的FAS表達水平極低，斷乳后喂飼高碳水化合物、低脂肪飼料時(shí)，FAS的合成加速，活性增強，機體脂肪合成能力迅速增加^[8]。本課題中FAS的表達趨勢與文獻報道一致，說(shuō)明脂肪攝入較多時(shí)（母乳）脂肪從頭合成較少，而當攝入標準飼料時(shí)，FAS基因被激活，脂肪從頭合成增加。DIRAISON報道FAS基因的表達降低，會(huì )減少細胞內TG的含量^[9]。同時(shí)有一研究發(fā)現，FAS的表達增加可以增加脂肪的積聚而發(fā)展為肥胖^[10]。本課題研究發(fā)現HP組褐色脂肪中FAS在高脂誘導肥胖前、后的表達水平均低于對照組，說(shuō)明孕期高蛋白飼料可通過(guò)降低子代脂肪合成而減少子代高脂誘導肥胖的發(fā)生。PEPCK不僅是糖異生的關(guān)鍵酶，也是甘油異生的關(guān)鍵酶，它與FAS一樣可導致體內儲存的脂肪增加。轉基因小鼠實(shí)驗顯示PEPCK活性的慢性增加能增強糖異生和FFA的再酯化作用^[11]。本研究中HP組的PEPCK基因表達持續低于對照組，說(shuō)明HP組的大鼠可以通過(guò)降低糖異生和甘油異生而降低高脂誘導肥胖的發(fā)生。

綜上所述，孕期適當增加蛋白質(zhì)攝入可使子代FAS和PEPCK基因的表達降低，進(jìn)而預防子代成年肥胖等慢性病的發(fā)生。因而FAS和PEPCK可作為防治肥胖的候選基因。關(guān)于生命早期不同膳食成分影響肥胖基因譜的機制還有待于更深入的研究。

 

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