(深圳市慢性病防治院，深圳，518020)

摘要：目的探討胃促生長(cháng)素(Ghrelin)在高脂飲食誘導大鼠肥胖中的作用。方法采用40只健康雄性SD大鼠，按體重隨機分為高脂實(shí)驗組和基礎對照組，分別給予高脂飼料(30只)和基礎飼料(10只)喂養12周。實(shí)驗結束時(shí)，將高脂組大鼠根據體重分為飲食誘導肥胖（DIO）和飲食誘導肥胖抵抗(DIR)大鼠，觀(guān)察各組大鼠能量攝入、體重增長(cháng)情況，比較血漿ghrelin、血糖、胰島素及血脂水平的差異；逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)測定胃壁組織ghrelin前體信使核糖核酸(mRNA)的表達水平。結果DIO大鼠能量攝入、體重增長(cháng)顯著(zhù)高于DIR和對照組大鼠（P＜0.05），而DIR大鼠與對照組相比差異無(wú)顯著(zhù)性（P＞0.05）；DIO大鼠血漿ghrelin和胃壁preproghrelin mRNA的表達水平均低于DIR大鼠和基礎對照組（P＜0.01）。結論高脂飲食下ghrelin表達和釋放減少與能量攝入過(guò)多和肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。
關(guān)鍵詞：高脂飲食；肥胖；胃促生長(cháng)素

Ghrelin and highfat diet induced obesity in rats

Liu Xiaoli
(Chronic Disease Hospital of Shenzhen)

 Abstract: Objective To explore the effects of expression and secretion of ghrelin on highfat diet induced obesity in rats.  Methods Forty male SD rats were randomly divided into highfat diet group (n=30) and chow fed control group (n=10), and given either highfat diet or chow for twelve weeks. Then the highfat diet group was subdivided into Dietary Induced Obesity (DIO) and Dietary Induced Obesity Resistant (DIR) group according to the final body weight. Fasting plasma ghrelin were determined by RIA. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) was used to measure the expression of preproghrelin mRNA in gastric tissue.  Results Cumulative caloric intake, body weight in DIO group were significantly higher than those in DIR and control group. Both fasting plasma ghrelin concentration and the preghrelin expression in gastric tissue were significantly lower in DIO group than in DIR and control group.  Conclusion Lower expression and secretion of ghrelin were closely associated with highfat diet induced obesity and their higher caloric intake.

Keywords highfat diet；obesity；ghrelin

Ghrelin是由28個(gè)氨基酸組成的肽類(lèi)激素，主要由胃和十二指腸分泌，為內源性生長(cháng)激素促分泌素受體的天然配體，故稱(chēng)作胃促生長(cháng)素[1-2]。研究發(fā)現，外周或中樞注射ghrelin均可引起動(dòng)物攝食增加和利用脂肪產(chǎn)熱減少，出現以脂肪組織蓄積為主的體重增加和肥胖，提示ghrelin對調節能量平衡起重要作用[3-4]。人和動(dòng)物血液循環(huán)中均有一定濃度的ghrelin,進(jìn)餐前，血液中g(shù)hrelin水平最高，進(jìn)食后，ghrelin迅速下降至較低的水平，由此推測ghrelin可能與饑餓感的產(chǎn)生及進(jìn)食行為的啟動(dòng)密切相關(guān)。
高脂飲食喂養的同種系大鼠,部分表現為多食和肥胖，稱(chēng)為飲食誘導肥胖(Dietary Induced Obesity, DIO)大鼠,部分則相應減少攝食量而不肥胖，稱(chēng)為飲食誘導肥胖抵抗(Dietary Induced Obesity Resistant, DIR)大鼠。本研究探討高脂飲食喂養條件下內源性ghrelin表達和分泌水平與其肥胖易感性差異性的關(guān)系。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗動(dòng)物
雄性SD大鼠40只，體重155-165g，購于上海西普爾—必凱實(shí)驗動(dòng)物有限公司（準SCXK(滬)2003-0002）。
1.2 飼料配方
基礎飼料購自華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心，總能量3.3kcal/g（蛋白質(zhì)21.88%、脂肪13.68%、碳水化合物64.44%）；自行配制的高脂飼料，每100g含基礎飼料60g、豬油15g、雞蛋黃粉10g、脫脂奶粉8g、干酪素5g、白沙糖2g，高脂飼料總能量4.6kcal/g（蛋白質(zhì)20.00%、脂肪49.85%、碳水化合物30.15%）。

1.3 實(shí)驗動(dòng)物的飼養與分組
購入大鼠適應性飼養一周后，按體重隨機分為兩組：基礎對照組（10只），喂以基礎飼料；高脂實(shí)驗組（30只），喂以高脂飼料。各組大鼠均單籠飼養，自由進(jìn)食、攝水，動(dòng)物房溫度（22±5）℃，相對濕度（50±10）%，明暗周期12∶12h。每周定時(shí)稱(chēng)體重。第12周末，將高脂實(shí)驗組大鼠按體重排序，以體重較大的1/3（10只）為DIO大鼠，體重較小的1/3（10只）為DIR大鼠，體重居中的1/3棄之不用。
1.4 資料及樣品收集
實(shí)驗期間每日觀(guān)察大鼠一般情況，記錄給食量和撒食量，計算攝食量，每周稱(chēng)體重，于實(shí)驗開(kāi)始和結束時(shí)隔夜禁食12h，次晨取尾血，加入預冷的含乙二胺四乙酸二鈉（EDTA二鈉，7.5%,每3毫升全血40μl)抗凝管中，加抑肽酶（每毫升全血500U），混勻，4℃離心15min（3000rpm）分離血漿，‐80℃保存待測。實(shí)驗結束時(shí)將大鼠斷頭處死,取胃體部胃壁組織,用0.9%生理鹽水沖洗后液氮速凍,‐80℃保存待測。
1.5 血漿ghrelin及其它生化指標的測定
采用液相競爭放射免疫檢測法測定血漿ghrelin和胰島素水平，葡萄糖氧化酶法測血糖,酶比色法測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)水平,ghrelin和胰島素放免試劑盒分別購自美國Phoenix公司和北京科美東雅生物技術(shù)有限公司，血糖、TG、TC、HDLC檢測試劑盒購自北京中生生物工程科技公司，均按公司提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測定。
1.6 胃組織preproghrelin mRNA的測定
按Trizol說(shuō)明書(shū)從50mg胃組織中提取總RNA。在25μl逆轉錄反應體系中，以1.0μg mRNA為模板將mRNA逆轉錄為cDNA。PCR反應以βactin作為內參照，βactin上游引物為5cat cac tat cgg caa tga gc3，下游引物為5 gac agc act gtg ttg gca ta 3（156bp）；preghrelin上游引物為5-GGA ATC CAA GAA GCC ACC AGC-3，下游引物為5-GCT CCT GAC AGC TTG ATG CCA-3(247bp)。PCR反應首先在95℃預變性5min，72℃延伸7min；95℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；最后一次循環(huán)在72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳并與DNA標準分子量比較鑒定，用Biometra成像系統進(jìn)行成像和圖像分析。preghrelin mRNA表達水平用目的基因條帶光密度值與β actin條帶光密度值之比表示。
1.7 統計學(xué)處理
全部數據錄入Microsoft Excel 2000,用SPSS 12.0統計軟件進(jìn)行統計分析，相關(guān)數據以x_±s表示，多個(gè)樣本均數間比較用方差分析。
2 結果
2.1 實(shí)驗各組大鼠體重變化趨勢分析
由圖1可知，隨著(zhù)喂養時(shí)間的推移，DIR大鼠與DIO大鼠的體重差別逐漸增大。從第3周開(kāi)始，DIR大鼠與DIO大鼠的體重已經(jīng)具有顯著(zhù)性差異（P＜0.05），但是DIOR大鼠與對照組大鼠體重始終未見(jiàn)顯著(zhù)性差異（P＞0.05）。

圖 1各組大鼠體重變化趨勢

Fig. 1The body weight of rats in each group

2.2 各組大鼠能量攝入量的比較
各組大鼠的累計攝食量和能量攝入量見(jiàn)表1。

表1各組大鼠進(jìn)食量和能量攝入量的比較
Table 1Cumulative food intake and caloric intake of different groups

同樣攝入高脂飼料的情況下，DIO組的累計攝食量顯著(zhù)高于DIR組。因基礎飼料和高脂飼料的能量密度不同，將食物攝入量換算成能量攝入量進(jìn)行比較，結果DIO大鼠累計能量攝入量顯著(zhù)高于對照組和DIR組，差異有極顯著(zhù)性（P＜0.01），而DIR和對照組相比，累計能量攝入差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。提示高脂飲食喂養條件下，肥胖易感大鼠攝入能量較多，而肥胖抵抗大鼠可自發(fā)性減少進(jìn)食量，使能量攝入不致過(guò)多。

2.3 各組大鼠實(shí)驗前后血漿ghrelin及其它生化指標的比較

如表2，實(shí)驗開(kāi)始時(shí)各組大鼠血漿ghrelin水平無(wú)顯著(zhù)性差異，喂養12周后，DIO組大鼠血漿ghrelin水平均顯著(zhù)低于DIR大鼠和基礎飼料喂養組，而DIR組與基礎對照組差異無(wú)顯著(zhù)性意義。此外，DIO組空腹血糖、胰島素、TG水平均顯著(zhù)高于對照組。

2.4 各組大鼠胃組織preproghrelin mRNA表達的比較
實(shí)驗結束時(shí)各組大鼠胃組織preproghrelin mRNA表達的結果見(jiàn)圖2和表3，DIO組顯著(zhù)低于DIR和對照(P＜0.05），而DIR和對照組之間未見(jiàn)顯著(zhù)性差別（p＞0.05）。

表2各組大鼠實(shí)驗前后空腹血漿ghrelin、胰島素、血糖、血脂譜水平（x-±s）

圖2大鼠胃組織preproghrelin mRNA表達電泳圖

Fig 2gastric tissue preproghrelin mRNA

表3.各組大鼠胃組織preproghrelin mRNA定量結果
Table 3.gastric tissue preproghrelin mRNA level

3 討論
本研究中，同樣用高脂飼料喂養的SD大鼠，自由攝食情況下，部分表現為能量攝入增加和肥胖（DIO），另一部分則可通過(guò)攝食量的減少，使能量攝入水平及體重增長(cháng)與基礎飼料喂養組無(wú)顯著(zhù)性差異（稱(chēng)之為DIR），再次證實(shí)能量過(guò)剩是肥胖的根本原因。
導致DIO和 DIR大鼠自發(fā)性能量攝入量差異的原因很多，食欲調節激素對飽腹感和饑餓感的調節在其中起著(zhù)非常重要的作用。Ghrelin是迄今所發(fā)現的唯一的一個(gè)具有增進(jìn)食欲生理活性的胃腸道激素，動(dòng)物和人體試驗都已證明：注射外源性ghrelin可引起饑餓感，使攝食明顯增加[5]。其作用機制與促進(jìn)下丘腦弓狀核神經(jīng)肽Y（NPY）神經(jīng)元活性及NPY表達和釋放有關(guān)[6]，也可能由下丘腦側區的增食欲素（orexin）通路介導[7]，且外周注射ghrelin產(chǎn)生的促食欲作用有賴(lài)于傳入迷走神經(jīng)的完整性[8]。而內源性ghrelin表達和分泌水平與高脂飲食誘導的肥胖動(dòng)物攝食過(guò)多和能量過(guò)剩的關(guān)系目前尚未見(jiàn)相關(guān)報道。本研究結果顯示：DIO大鼠空腹血漿ghrelin水平顯著(zhù)低于DIR組及基礎飼料對照組。與此一致，人類(lèi)肥胖者也表現為空腹ghrelin水平下降[9]，這是否與肥胖者中樞神經(jīng)系統對ghrelin的敏感性發(fā)生改變有關(guān)還有待研究。Beck B等認為：食物中不同的宏量營(yíng)養素對胃腸道ghrelin的釋放有不同的影響，長(cháng)期攝入高脂飲食可抑制ghrelin的釋放，而血漿ghrelin水平低與食物選擇上偏愛(ài)高脂肪有關(guān)[10]。本研究表明長(cháng)期高脂飲食條件下，DIO組ghrelin表達和分泌明顯下降，而DIR組ghrelin表達和分泌與對照組無(wú)顯著(zhù)性差異，這可能與DIO大鼠喜食高脂飼料，高脂飼料喂養時(shí)能量攝入過(guò)多有關(guān)，而同樣飼以高脂飼料的DIR大鼠，ghrelin分泌下降不明顯，可能與其對高脂飼料無(wú)明顯偏愛(ài)，可根據能量攝入水平自發(fā)性減少攝食量有關(guān)。此外，進(jìn)食后ghrelin分泌下降可能對飽腹感的產(chǎn)生有關(guān)，Lindqvist等認為高脂飼料喂養致空腹時(shí)低水平ghrelin表達和分泌還影響進(jìn)食對ghrelin表達和分泌的抑制作用[11]，使進(jìn)食后血漿ghrelin濃度下降不明顯，不能及時(shí)產(chǎn)生飽腹感而至攝入過(guò)多。DIO和DIR大鼠攝入不同飼料后ghrelin表達和分泌譜的變化是否也存在差異有待進(jìn)一步研究。