王重建 楊年紅 郝麗萍 聶紹發(fā)

 

(武漢華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院公共衛生學(xué)院，武漢，430030)

 

摘要：目的探討食欲調節激素NPY、PYY336與高脂飲食誘導大鼠肥胖和肥胖抵抗的關(guān)系及肥胖易感性差異的機制。方法雌性SD大鼠36只，按體重隨機分為高脂組(N=27)和對照組(CF,n=9)，分別給予高脂飼料和基礎飼料。第13周末，根據體重將高脂組分為飲食誘導肥胖（DIO,n＝13）和肥胖抵抗(DIOR,n=9)大鼠，觀(guān)察各組大鼠體重、熱能攝入量及能量利用率的差異，RIA測定血漿NPY與PYY336含量，熒光實(shí)時(shí)定量PCR測定下丘腦NPY及回結腸PYY mRNA的表達水平。結果DIO大鼠體重、熱能攝入量及能量利用率顯著(zhù)高于CF大鼠和DIOR大鼠（P＜0.01），而DIOR大鼠與CF大鼠相比無(wú)顯著(zhù)性差異；DIO大鼠下丘腦NPY mRNA表達水平顯著(zhù)高于CF大鼠和DIOR大鼠（P＜0.01），而DIOR大鼠與CF大鼠相比無(wú)顯著(zhù)性差異；DIOR大鼠血漿PYY336含量及回結腸PYY mRNA表達水平均顯著(zhù)高于CF大鼠和DIO大鼠（P＜0.01），DIO大鼠與CF大鼠相比，除回腸PYY mRNA的表達水平升高，其余指標均無(wú)顯著(zhù)性差異（P＞0.05）。討論食欲調節激素NPY、PYY336表達和分泌水平的差異與高脂飲食條件下大鼠肥胖和肥胖抵抗的形成密切相關(guān)，其可能是導致大鼠發(fā)生肥胖易感性差異的機制之一。

 

關(guān)鍵詞：神經(jīng)肽Y;肽YY;高脂飲食;肥胖;肥胖抵抗

 

Relation between appetiteregulating hormones and obesity susceptibility in rats

Wang ChongjianYang NianhongHao LipingNie Shaofa

(School of Public Health, Tongji Medical college, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan, 430030)

 

Abstract：ObjectiveTo explore the relation between NPY, PYY336 and obesity susceptibility in rats, and the corresponding mechanism.MethodsThirtysix female SD rats were randomly divided into highfat diet group (n=27) and control group (CF, n=9), and given either highfat diet or chow for 13w. Then the highfat diet group was subdivided into dietinduced obesity (DIO) and dietinduced obesity resistant (DIOR) rats according to the final body weight. Body weight, caloric intake, energy efficiency, the plasma concentration of NPY, PYY336, the expression levels of hypothalamic NPY and ileocolon PYY mRNA were measured and compared. ResultsBody weight, caloric intake, energy efficiency, and the expression of NPY mRNA of DIO rats were higher significantly than those of CF and DIOR rats, while no significant difference between DIOR and CF rats. The concentration of PYY336 and the expressions of PYY mRNA of ileocolon in DIOR rats were higher significantly than that of the DIO and CF rats (P＜0.01), while no significant differenc was found between DIO and CF rats (P＞0.05), except that PYY mRNA of ileum was advanced in DIO rats (P＜0.01). ConclusionThe different of NPY, PYY336 levels could play an important role for the susceptibility on highfat diet induced obesity.

 

Keywords: Neuropeptide Y; Peptide YY; Highfat diet; Obesity; Obesity resistant

 

 

高脂飼料喂養的動(dòng)物，表現為飲食誘導肥胖(Dietinduced Obesity, DIO)和肥胖抵抗(Dietinduced Obesity Resistant, DIOR)兩種不同的表型[1,2]，與高脂膳食下人群肥胖的發(fā)生機制非常相似。下丘腦是機體能量平衡的調節中樞，由下丘腦弓狀核神經(jīng)元分泌和釋放的神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y, NPY)是一種促食欲調節激素[3]。肽YY(Peptide Y, PYY)是由胃腸道L細胞合成和分泌的一種抑食欲調節激素[4,5]，它在循環(huán)系統中主要以PYY336的形式存在[6,7]。本文通過(guò)觀(guān)察高脂飲食誘導的肥胖和抵抗大鼠熱能攝入量、能量利用率、血漿NPY和PYY336水平以及相應組織NPY、PYY基因表達水平的差異，探討高脂膳食條件下大鼠發(fā)生肥胖及肥胖抵抗的機制，為有效預防人類(lèi)肥胖的發(fā)生提供理論依據。

 

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與飼料

雌性SD大鼠36只，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗動(dòng)物有限公司（準SCXK滬2003-0002），體重150～160g。基礎飼料購自華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心，熱能含量3.29kcal/g（蛋白質(zhì)供能占21.9%、脂肪供能占13.7%、碳水化物供能占64.4%）；高脂飼料參照文獻配制[2]，熱能含量4.62kcal/g（蛋白質(zhì)供能占20.0%、脂肪供能占49.9%、碳水化物供能占30.1%）。

1.2 動(dòng)物飼養與分組

購入大鼠適應性飼養1周后，按體重隨機分為兩組：正常對照組9只，喂以基礎飼料(Chow food, CF)；高脂組27只，喂以高脂飼料(Highfat, HF)。各組大鼠均單籠飼養，自由攝食、飲水，動(dòng)物房溫度(22±5)℃，相對濕度(50±10)%。于第13周末，參照CF大鼠平均體重及標準差，將高脂飼養組再分為DIO大鼠（體重大于CF大鼠平均體重加1.96倍標準差，n＝13）和DIOR大鼠（體重小于CF大鼠平均體重加1倍標準差，n＝9）。

1.3 相關(guān)指標和組織樣本收集

實(shí)驗期間每日觀(guān)察大鼠一般情況，記錄給食量和撒食量，計算攝食量，每周稱(chēng)體重。第13w末，過(guò)夜禁食10h后斷頭處死，收集全血，加入預冷的7.5%，含EDTA二鈉(3ml全血加40μl)抗凝管中，加抑肽酶（1ml全血加500U），混勻，4℃離心15min（3000r/min）分離血漿，－20℃保存待測。迅速取出全腦，參照文獻[8]和大鼠腦冠狀面圖譜對下丘腦進(jìn)行定位并分離，置液氮凍存，以備RNA抽提。以盲腸定位，分離大鼠固定部位回腸和結腸，每段取1.0cm左右，用高壓滅菌的DEPC水沖洗干凈后，在高壓滅菌的濾紙上吸干，迅速置液氮中凍存，以備RNA抽提。

1.4 血漿PYY336和NPY的測定

采用液相競爭放射免疫檢測法測定血漿PYY336和NPY含量。PYY336放射免疫檢測試劑盒購于美國PhoenixBiotech公司，NPY放射免疫檢測試劑盒購自北京東雅生物技術(shù)研究所。

1.5  RNA提取及熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應

按Trizol說(shuō)明書(shū)提取下丘腦和回結腸組織總RNA，核酸蛋白測定儀測量RNA濃度，在25μl反應體系中，以2.5μg mRNA為模板逆轉錄為cDNA后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴增。自基因庫檢索目的基因和βactin cDNA序列，設計PCR引物[9]，βactin(156bp)上游引物：5catcactatcggcaatgagc3，下游引物：5gacagcactgtgttggcata3；NPY(225bp)上游引物：5tccgctctgcgacactacatc3，下游引物：5aggcagactggtttcacagga3；PYY（215bp）：上游引物：5cctaccccgctaaaccagag3，下游引物：5tcaccactggtccacaccttc3；SYBR Green PCR擴增程序：50℃ 2min(UDG孵育)，95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 60s，40個(gè)循環(huán)。

用ΔΔCT法對熒光定量PCR結果進(jìn)行定量分析。CT值為熒光信號有統計學(xué)意義顯著(zhù)增長(cháng)時(shí)的循環(huán)次數，ΔCT值為目的基因CT值與管家基因(βactin)CT值的差值，ΔΔCT為各試驗組ΔCT與選擇的對照組ΔCT的差值。平均相對含量=2—平均ΔΔCT，為相對于CF大鼠mRNA的水平。

1.6 統計分析

全部數據用Microsoft Excel 2003錄入，數據以x-±s 表示，采用 SPSS 12.0 軟件進(jìn)行統計分析。

 

2 結果

2.1 大鼠體重變化

實(shí)驗開(kāi)始時(shí)，三組大鼠體重無(wú)顯著(zhù)性差異，隨著(zhù)喂養時(shí)間的推移，各組大鼠體重之間的差異逐漸增加（如圖1所示）。實(shí)驗結束時(shí)，DIO 大鼠體重（343.35±17.56g）顯著(zhù)高于CF大鼠（282.06±20.60g）和DIOR 大鼠（290.78±16.63g）（P＜0.01），而 DIOR 大鼠與CF大鼠相比未見(jiàn)顯著(zhù)性差異（P＞0.05）。

Fig. 1Weekly body weights were measured in DIO, DIOR and CF rats.

 

2.2 大鼠熱能攝入量和能量利用率的比較

由于基礎飼料和高脂飼料的熱能密度不同，故將食物攝入量換算為熱能攝入量進(jìn)行比較。喂養期間各組大鼠總的熱能攝入量分別為：DIO(6363.58±471.16)kcal，DIOR(5496.76±327.07)kcal，CF(5631.29±370.78)kcal，DIO大鼠熱能攝入量顯著(zhù)高于CF大鼠和DIOR大鼠(P＜0.01)，DIOR大鼠和CF大鼠相比無(wú)顯著(zhù)性差異(Fig. 2A)。喂養期間各組大鼠總的能量利用率[能量利用率=體重增量(g)/同期熱能攝入量(kJ)×100%]分別為DIO(2.85±0.25)%，DIOR(2.36±0.30)%，對照組(2.14±0.34)%，DIO大鼠與CF大鼠和DIOR大鼠相比均有極顯著(zhù)性差異(均P＜0.01)，DIOR大鼠和CF大鼠相比，差異無(wú)顯著(zhù)性意義(Fig. 2B)。

 

Fig. 2Weekly caloric intake (A) and energy efficiency (B) were measured in DIO, DIOR and CF rats.

 

2.3 血漿PYY和NPY水平比較

各組大鼠血漿PYY336的水平分別為DIO(38.78±5.68)pg/ml，DIOR(53.03±9.64)pg/ml，CF(35.54±8.74)pg/ml，統計分析顯示，DIOR大鼠血漿PYY336含量顯著(zhù)高于CF大鼠和DIO大鼠(P＜0.01)，DIO大鼠與CF大鼠相比差異無(wú)統計學(xué)意義(P＞0.05)。各組大鼠血漿NPY 水平分別為DIO(8.67±0.67)pg/ml，DIOR(8.40±0.71)pg/ml，CF(8.15±1.14)pg/ml，統計分析無(wú)顯著(zhù)性差異(P＞0.05)。

 

2.4 NPY與PYY mRNA 表達水平的比較

如圖3A所示，DIO大鼠下丘腦 NPY mRNA的表達水平顯著(zhù)高于CF大鼠和 DIOR大鼠(P＜0.01)，而 DIOR 大鼠與CF大鼠相比差異無(wú)統計學(xué)意義(P＞0.05)。如圖B,C所示，DIOR大鼠回結腸PYY mRNA表達水平均顯著(zhù)高于DIO和CF大鼠(P＜0.01)，而DIO與CF大鼠相比，回腸PYY mRNA表達水平顯著(zhù)升高(P＜0.01)，結腸PYY mRNA表達水平無(wú)顯著(zhù)性(P＞0.05)。

Fig. 3Hypothalamic NPY (A), ileum PYY (B), colon PYY (C) mRNA expression levels were measured by realtime PCR in DIO, DIOR and CF rats fed the highfat diet or chow diet.

 

3 討論

下丘腦是機體的食欲調節中樞，通過(guò)復雜的"食欲調節網(wǎng)絡(luò )"接受和傳遞各種食欲調節因子（包括促食欲激素和抑食欲激素）的信號，對食欲進(jìn)行綜合的調節[4,10]。作為"食欲調節網(wǎng)絡(luò )"中重要的食欲調節激素，NPY和PYY336對機體能量攝入、貯存、消耗及能量平衡起著(zhù)重要的調節作用[11,12]。實(shí)驗結果顯示，同種系、同性別大鼠對高脂飼料誘導肥胖的易感性存在較大的個(gè)體差異，表現為飲食誘導肥胖和肥胖抵抗兩種不同的表型，自由攝食飲水的條件下，熱能攝入高者發(fā)展為肥胖，熱能攝入接近CF大鼠者不肥胖，提示DIOR大鼠暴露于高脂飼料時(shí)可通過(guò)減少進(jìn)食量而調節能量攝入水平，而DIO大鼠由于缺乏這一自我調節能力，從而導致能量攝入過(guò)多并發(fā)生肥胖。

進(jìn)一步研究發(fā)現，DIOR大鼠血漿中抑食欲激素PYY336含量及回結腸PYY mRNA的表達水平較DIO大鼠均顯著(zhù)升高，促食欲激素NPY mRNA 表達水平較DIO大鼠顯著(zhù)下降，提示DIOR大鼠體內抑制食欲激素水平的升高、促食欲激素水平的下降抑制了熱能的攝入，從而誘導肥胖抵抗的發(fā)生；與此相反的是，DIO大鼠體內抑食欲激素水平僅維持在基礎對照組水平，促食欲激素水平的升高促進(jìn)了熱能的攝入，從而誘導肥胖的發(fā)生。總之，食欲調節激素NPY、PYY在飲食誘導肥胖易感性的差異中可能扮演了重要的角色，NPY、PYY表達和分泌水平的差異與高脂飲食條件下大鼠肥胖和肥胖抵抗的形成密切相關(guān)，但是高脂膳食條件下食欲調節激素NPY及PYY表達和分泌差異的機制還有待深入研究。

 

參考文獻

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