應晨江 李彥榮 易海維 孟依衣 衛杰 孫秀發(fā)

(華中科技大學(xué)公共衛生學(xué)院營(yíng)養與食品衛生學(xué)系,湖北武漢,430030)

 

摘要：目的來(lái)自?xún)绕ば鸵谎趸厦福╡NOS）的NO，在血管生成、血管重構、以及內皮細胞滲透性方面有著(zhù)深遠的影響，NO下降是內皮功能失調的重要標志，同時(shí)也是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病人血管病變的病理基礎，而內皮細胞窖蛋白-1（Caveolin1,Cav-1）又是eNOS的負調控開(kāi)關(guān)。因此我們在前面證實(shí)茶多酚通過(guò)調控ROS,影響內皮細胞功能的基礎上，進(jìn)一步探討綠茶茶多酚(GTP)對eNOS和Cav1表達的影響。方法在體外培養BAEC中，加入終濃度為4μg/ml GTP，分別作用0、4、8、12、16和24小時(shí)；另用不同濃度的GTP作用于內皮細胞；用免疫印跡法檢測eNOS和Cav1蛋白表達水平，RTPCR檢測eNOS和Cav1 mRNA表達水平。結果eNOS mRNA水平的表達從GTP作用4小時(shí)后開(kāi)始上升；eNOS蛋白表達在8小時(shí)后開(kāi)始增加，并可以維持到24小時(shí)。劑量－效應關(guān)系表明4μg/ml的GTP對eNOS蛋白和mRNA的表達上調作用最明顯。Cav1 mRNA表達水平在GTP作用4小時(shí)開(kāi)始下降，可以維持到8小時(shí)，Cav1蛋白水平在GTP作用12小時(shí)開(kāi)始下降，可以維持到24小時(shí)以上。結論GTP可以增加內皮細胞eNOS mRNA和蛋白水平，同時(shí)GTP可降低內皮細胞Cav-1 mRNA和蛋白表達，提示茶多酚可能通過(guò)NO產(chǎn)生途徑改善內皮功能。

關(guān)鍵詞：茶多酚；內皮細胞；內皮型一氧化氮合酶；窖蛋白-1

 

血管內皮中的NO由內皮型一氧化氮合酶（eNOS）產(chǎn)生，對于維持血管正常緊張度有重要的意義。eNOS產(chǎn)生的NO和其他的一些激素及信號物質(zhì)共同參與血管緊張度和血壓的調節，是一種主要的舒張血管的分子。內皮細胞產(chǎn)生的NO還可以與活性氧族反應，減少活性氧族對血管組織的損傷，起到維護血管功能的作用。另外，近來(lái)發(fā)現NO還具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，主要是抑制血小板聚集、白細胞粘附、平滑肌細胞增生和粥樣形成涉及的基因表達[1]。活性氧的增加和NO生物功能的喪失,進(jìn)而產(chǎn)生內皮功能障礙對于高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有重要意義[2]。因此eNOS功能損傷是心血管疾病的主要病理表現，也是心血管藥物藥理作用的靶點(diǎn)之一[1]。

胞膜窖（caveolae）是胞膜上直徑約50-100nm，富含膽固醇，鞘磷脂和鞘磷糖的燒瓶狀膜內陷區域[3]。Caveolin1（Cav1）是胞膜窖的標志性蛋白，在血管內皮細胞和脂肪細胞中含量最高，Cav1可以調節胞膜窖中的膽固醇含量，參與膽固醇在內質(zhì)網(wǎng)到胞膜之間的穿梭運動(dòng)[4]；還參與脂肪代謝；更為重要的是它參與并且在細胞信號轉導中發(fā)揮“主宰調節者”的作用。許多信號分子（G蛋白、激酶等）與Cav1結合，這種結合可以讓這些信號分子處于靜止或抑制狀態(tài)，例如產(chǎn)生NO的eNOS就位于Cav1的腳手架區，使其處于無(wú)活性狀態(tài)[5]。一些具有重要生理功能的分子，如胰島素受體，血管緊張素II受體I型（AT1）也存在于胞膜窖中。

茶多酚是茶葉中的主要活性成分，近些年的實(shí)驗表明茶多酚具有抗癌、清除氧自由基、抑制血壓升高、降低血糖和降低血膽固醇的作用[6]。流行病學(xué)調查已經(jīng)證實(shí)茶的消費和心血管疾病危險性之間呈負相關(guān)[7]。臨床交叉試驗表明短期和長(cháng)期飲用紅茶可以改善冠狀動(dòng)脈疾病的內皮收縮功能失調[8]。最近已經(jīng)有實(shí)驗揭示了綠茶茶多酚的重要成分EGCG通過(guò)短時(shí)間作用內皮細胞，激活PI3激酶、蛋白激酶B（PKB/Akt）和PKA進(jìn)而增加eNOS的活性[9]。然而，綠茶茶多酚長(cháng)時(shí)間作用對內皮細胞產(chǎn)生有益作用的機理還不清楚，本研究部分探討茶多酚對內皮細胞eNOS和Cav1基因表達水平的影響。

 

材料與方法

1．材料

綠茶茶多酚由聯(lián)合利華健康研究所（荷蘭）惠贈。DMEM低糖培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclon公司。脫氧膽酸鈉、過(guò)硫酸胺、SDS和NaVO3購自Sigma；DTT、PMSF、Aprotinin購自Roche公司；Leupeptin、Tween20、TEMED、二巰基乙醇和雙丙烯酰胺購自Promega公司；丙烯酰胺購自Fluka；硝酸纖維素膜購自PALLGelman公司（美國）；蛋白定量試劑盒、電泳和轉膜裝置為BioRad公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光劑和顯影暗盒購自Amersham公司，顯影膠片為購自寶麗萊T667膠片。eNOS抗體購自Cayman公司，Cav1抗體購自Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標記的抗兔二抗購自Sigma公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑。PCR儀和圖形分析儀為Biometra公司產(chǎn)品。

 

2.方法

2.1 細胞培養

牛胸主動(dòng)脈內皮細胞（BAECs）采集方法見(jiàn)第三部分，原代培養方法參照文獻[10]，選用5－15代細胞用作實(shí)驗用。細胞用含10％胎牛血清的DMEM低糖培養基培養于37℃、含5％CO2的培養箱中。

 

2.2 細胞處理

當細胞長(cháng)到80％時(shí)，DMEM培養基中加入4μg/ml的綠茶茶多酚分別作用細胞0、4、8、12、16和24小時(shí)，每組中隨機選取三皿細胞刮下加入細胞裂解液處理，另外三皿細胞加入Trizol處理提取mRNA。另外一組實(shí)驗DMEM培養基中加入0、0.04、0.4、4、40μg/ml的茶多酚，作用8小時(shí)后，每組三皿細胞用Trizol處理提取mRNA；另外每組三皿細胞作用12小時(shí)后，用細胞刮刮下加入細胞裂解液處理。

 

2.3 免疫印跡檢測

細胞用細胞裂解液溶解后提取全細胞蛋白。經(jīng)蛋白質(zhì)定量，蛋白質(zhì)電泳分離（SDSPAGE）和免疫印跡按參考文獻[11]的方法進(jìn)行，eNOS一抗反應滴度為1∶4000，α－tubulin一抗反應滴度為1∶1000，Cav1一抗反應滴度為1∶400，二抗用滴度為1∶30000。免疫反應帶用ECL試劑盒檢測，化學(xué)發(fā)光信號用自顯影膠片記錄，掃描儀掃描，用Biometra圖形分析儀對條帶積分光密度定量分析。

 

2.4 RTPCR檢測eNOS和Cav1的mRNA水平

Trizol提取細胞mRNA的方法依說(shuō)明書(shū)操作。逆轉錄反應體系為25μl反應體系，將mRNA逆轉錄為cDNA。eNOS上游引物為5GGA GAG GCT GCA TGA CAT TG 3，下游引物為5GGT AGA GCC ATA GTG GAA TGA C 3，反應產(chǎn)物599bp；Caveolin1上游引物為，5TAC AAG CCC AAC AAC AAG G3下游引物為5ACA GTG AAG GTG GTG AAG C3，反應產(chǎn)物 209bp;GAPDH上游引物為5ATG ACC ACT GTC CAC GCC AT 3，下游引物為5GCC TGC TTC ACC ACC TTC TT 3。PCR反應體系為25μl反應體系，eNOS反應條件為：94℃變性1分鐘，59℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，30個(gè)循環(huán)；GAPGH反應條件為94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，29個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳并與DNA標準比較，然后在數字成像儀上照相分析。

 

2.5 統計分析

組間比較采用方差分析，統計分析軟件為SAS 8.0。

結果

1.綠茶茶多酚與內皮細胞eNOS基因表達水平的時(shí)間關(guān)系

與0小時(shí)相比，4μg/ml綠茶茶多酚作用內皮細胞4、8、12小時(shí)的eNOS mRNA表達水平明顯增加，于8h出現峰值,而在16小時(shí)和24小時(shí)時(shí)沒(méi)有顯著(zhù)差異（Table 1和Fig.1）。與0小時(shí)相比，4μg/ml茶多酚作用內皮細胞8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)和24小時(shí)的eNOS蛋白表達水平顯著(zhù)升高，差異具有極顯著(zhù)性（Table 1和Fig.2）。上述結果表明了綠茶茶多酚可以上調內皮細胞eNOS的表達,在時(shí)間上符合先mRNA后蛋白表達的特點(diǎn)。

 

2．綠茶茶多酚與內皮細胞eNOS基因表達水平的劑量—反應關(guān)系

與對照組相比，0.04、0.4、4和40μg/ml的GTP作用于BAEC后8小時(shí)均可增加eNOSmRNA的表達水平，差異具有顯著(zhù)性（Table 2和Fig.3），且4μg/ml組的增加作用最強。0.4、4和40μg/ml的GTP作用BAEC12小時(shí)可以明顯增加eNOS的蛋白表達水平，差異具有顯著(zhù)性（Table 2和Fig.4），4μg/ml組的增加作用最強。上述結果表明了綠茶茶多酚上調內皮細胞eNOS的表達,在一定范圍內存在劑量-反應關(guān)系。

3.綠茶多酚對內皮細胞Cav-1基因表達的影響

4μg/ml的綠茶多酚作用于BAECs，與0h相比，Cav1的mRNA水平在4h開(kāi)始下降（P＜0.05），8h降到最低（P＜0.05），12、16、24h的Cav1的mRAN表達水平與0h相比沒(méi)有統計學(xué)意義（P＞0.05，Table 3和Fig.5）。4h時(shí)Cav1的蛋白降到最低，8h時(shí)有所增加，但仍比0h低（P＜0.05），

 

本實(shí)驗表明綠茶茶多酚可以提高內皮細胞eNOS的蛋白表達和mRNA水平，并可以維持較長(cháng)時(shí)間；且存在劑量反應關(guān)系,實(shí)驗表明濃度為4μg/ml綠茶茶多酚增加其表達作用最強。綠茶中的主要活性成分是多酚類(lèi)，主要認為是兒茶酚，占綠茶茶多酚重量的大約30％[12]。本實(shí)驗揭示的茶多酚作用的最佳濃度為4μg/ml，則兒茶酚的濃度為1μg/ml。而以前研究顯示人血清中兒茶素的最高濃度可以達到約1μg/ml[13]。因而本實(shí)驗所揭示的最佳劑量水平同人體水平很接近，具有重要的實(shí)際指導意義。

我們曾報道過(guò)茶多酚可以抑制內皮細胞的NADPH氧化酶亞基P22phox和P67phox的表達，減少內皮細胞活性氧的產(chǎn)生，起到保護內皮細胞的作用[14]。本試驗顯示茶多酚可以提高內皮細胞的eNOS的蛋白和mRNA水平，說(shuō)明茶多酚對內皮細胞中氧化還原體系的多種酶的表達有調控作用。天然多酚類(lèi)抗氧化劑對內皮細胞的eNOS的表達有調節作用已有相關(guān)報道，如Jürgen F. Leikert發(fā)現紅酒多酚處理人臍靜脈內皮細胞可以提高eNOS的mRNA和蛋白水平，并可以增加NO的釋放[15]。Xu等研究發(fā)現Cy3G（一種花青素）作用牛內皮細胞后，可以時(shí)間和劑量依賴(lài)性增加內皮細胞的eNOS的表達，而且是通過(guò)SrcERK1/2Sp1信號途徑對eNOS進(jìn)行調控的[16]。最近已經(jīng)有學(xué)者提出氧化損傷是心血管疾病、糖尿病和胰島抵抗的共同土壤學(xué)說(shuō)，認為氧化損傷是這些疾病的共同原因[17]。作為抗氧化體系中重要的成分NO在抵抗活性氧的損傷中有重要的意義，茶多酚提高內皮細胞eNOS的基因和蛋白表達為增加NO的產(chǎn)生量和改善內皮功能提供了物質(zhì)基礎。茶多酚增加內皮細胞eNOS的表達和以前實(shí)驗顯示的茶多酚抑制NADPH氧化酶亞基和增加SOD的表達可以揭示飲茶改善內皮功能的內在機理。茶多酚對eNOS的mRNA和蛋白表達均有增加作用，說(shuō)明茶多酚至少在轉錄水平上提高了eNOS的表達，進(jìn)而增加蛋白表達。對eNOS轉錄水平的調節主要是調節轉錄因子的活性和對轉錄后的mRNA的穩定性的調節。茶多酚的主要成分EGCG作用的目標是轉錄因子和轉錄因子相關(guān)的信號轉導。有研究表明EGCG可以通過(guò)調控P38MAPK等多條信號通路提高AP1的蛋白水平及其與DNA啟動(dòng)子的結合能力[18]。另一方面,我們在前面部分研究中觀(guān)察到,紅茶茶多酚能推遲和減弱AngII刺激的p38MAPK磷酸化,通過(guò)改變ROS水平影響細胞信號轉導,由于細胞信號具有的復雜性,值得進(jìn)一步研究。

Cav1作為eNOS的上游抑制分子[19]，而本實(shí)驗的研究表明，綠茶多酚可以降低BACEs的Cav1蛋白和mRNA水平，因此初步得出綠茶多酚可以通過(guò)減弱Cav1對eNOS的活性抑制，為茶多酚應用于心血管疾病的預防的信號分子機理上有了進(jìn)一步的了解，也為在其它細胞（如脂肪細胞）中研究茶多酚調控Cav1的機理提供可能性。

總之，本實(shí)驗表明茶多酚可以提高牛內皮細胞eNOS的mRNA和蛋白表達，減低Cav1的mRNA和蛋白表達,這對于維持NO的水平,抵抗氧自由基對內皮的損傷，維持血管內皮的正常功能有重要的意義。

 

參考文獻

[1] Gewaltig M, Kojda G.. Vasoprotection by nitric oxide: mechanims and therapeutic potential. Cardiovascular Research, 2002, 55:250.

[2] Wattanapitayakul SK, Weinstein DM, Holycross BJ, et al. Endothelial dysfunction and peroxynitrite formation are early events in angiotensininduced cardiovascular disorders. FASEB J, 2000, 14:274-278.

[3] Parton, R.G. Caveolae and caveolins. Curr. Opin. Cell Biol., 1996,8:542-548.

[4] Murata M, Peranen J, Schreiner R, et al. VIP21/caveolin is a cholesterolbinding protein. Proc Natl Acad Sci USA 1995.,92:10339-10343.

[5] Leikert J, R thel TR, Wohlfart P, et al. Red wine polyphenols enhance endothelial nitric oxide synthase expression and subsequent nitric oxide release from endothelial cells. Circulation, 2002, 106:1614-1617.

[6] RiceEvans CA, Miller NJ.Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends in plant science, 1997, 2:152-159

[7] Arts ICW, Hollman PCh, Feskens EJM, et al. Catechin intake might explain the inverse relation between tea consumption and ischemic heart disease: the Zutphen Elderly Study. Am J Clin Nutr 2001; 74:227-232.

[8] Duffy SJ, Keaney JF, Holbrook M, et al. Shortand longterm black tea consumption reverse endothelial dysfunction in patients with coronary artery disease. Circulation,2001, 104:151-156.

[9] Lorenz M, Wessler S, Follmann E, et al. A constituent of green tea, epigallocatechin3gallate, activates endothelial nitric oxide synthase by a phosphatidylinositol3ohkinase, AMPdependent protein kinase, and Aktdependent pathway and leads to endothelialdependent vasorelaxation. J Biol Chem, 2004, 279:6190-6195.

[10] Marin V, Kaplanski G, Gr s S, et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of immunological methods,2001,254:183-190.

[11] 苗升浩，孫秀發(fā)，應晨江.蝦青素對內皮細胞過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶-1表達的影響.華中醫學(xué)雜志，2004，28：79-80.

[12] Lee MJ, Maliakal P, Chen L,et al.Pharmacokinetics of tea catechins after ingestion of green tea and ()epigallocatechin3gallate by humans: formation of different metabolites and individual variability. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 2002,11(10 Pt 1):1025-32.

[13] Yang CS, Chen L, Lee MJ, et al. Blood and urine levels of tea catechins after ingestion of different amounts of green tea by human volunteers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.,1998,7(4):351-4.

[14] Ying CJ, Xu JW, Ikeda K, et al. Tea polyphenols regulate nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase subunit expression and ameliorate angiotensin IIinduced hyperpermeability in endothelial cells. Hypertens Res.,2003,26(10):823-8.

[15] Leikert JF, Rathel TR, Wohlfart P, et al. Red wine polyphenols enhance endothelial nitric oxide synthase expression and subsequent nitric oxide release from endothelial cells. Circulation.,2002,106(13):1614-7.

[16] Xu JW, Ikeda K, Yamori Y. Upregulation of endothelial nitric oxide synthase by cyanidin3glucoside, a typical anthocyanin pigment. Hypertension,2004,44(2):217-22.

[17] Ceriello A, Motz E. Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance,diabetes, and cardiovascular disease? The common soil hypothesis revisited. Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2004, 24(5):816-23.

[18] Balasubramanian S, Efimova T, Eckert RL. Green tea polyphenol stimulates a Ras, MEKK1, MEK3, and p38 cascade to increase activator protein 1 factordependent involucrin gene expression in normal human keratinocytes. J Biol Chem.,2002,277(3):1828-36.

[19] Fleming I and Busse R.Molecular mechanisms involved in the regulation of the endothelial nitric oxide synthase.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2003，284:R1–R12.