高脂飲食對大鼠主動(dòng)脈eNOS和Cav-1的影響
應晨江 楊年紅 許明佳 李彥榮 衣衛杰 劉烈剛 孫秀發(fā)
(華中科技大學(xué)公共衛生學(xué)院營(yíng)養與食品衛生學(xué)系,湖北武漢,430030)
摘要:目的窖蛋白1(Cav-1)是內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的負調節蛋白,影響到心血管功能的多個(gè)方面。本研究旨在了解高脂膳食對血管Cav-1表達和eNOS活性的影響。方法雄性SD大鼠隨機分為對照組和試驗組。試驗組用高脂飼料喂養15周,誘導肥胖(DIO)和肥胖抵抗(DR)后,再將DIO組大鼠一半改用基礎飼料飲食喂養干預(DIO-LF),另一半繼續維持高脂飲食(DIOHF)。對照組大鼠一直用基礎飼料喂養。第23周實(shí)驗結束時(shí)處死動(dòng)物,取主動(dòng)脈用RTPCR、免疫印跡及免疫組化方法檢測血管Cav-1表達水平,Griess試劑測定NOS活性,蛋白激酶B(PKB/Akt)磷酸化及eNOS表達和磷酸化通過(guò)免疫印跡檢測。結果(1)高脂膳食上調DIO大鼠主動(dòng)脈Cav-1蛋白表達,下調eNOS表達,在DR大鼠中未見(jiàn)到此作用;(2)DIO大鼠主動(dòng)脈中NOS活性下降,而DR大鼠中未見(jiàn)到此現象;(3)DIO大鼠(不論是DIOHF,還是DIO-LF)主動(dòng)脈中PKB/Akt、和eNOS(ser1177)磷酸化作用增強。結論本研究結果提示高脂飲食喂養大鼠主動(dòng)脈中NOS活性下降,至少部分是和Cav1表達增強有關(guān)。
關(guān)鍵詞:飲食誘導肥胖;內皮型一氧化氮合酶;窖蛋白1;蛋白激酶B
肥胖是引起心血管疾病最重要的危險因素之一[1]。但是其內在機制尚不十分清楚,有研究揭示出超重者中存在著(zhù)血管內皮功能失調的現象,并推測體內過(guò)量?jì)Υ娴闹疽l(fā)的代謝和炎癥反應可能涉及其中[2]。發(fā)現受損的內皮細胞功能遠早于血管異常的臨床表現和癥狀[3]。
健康的內皮有賴(lài)于一系列抗炎癥,抗纖維化,血管舒張功能的平衡,而這些平衡功能很大程度上需要一氧化氮(NO)來(lái)維持。在內皮中NO由內皮型NO合酶(eNOS)合成,許多生理病理過(guò)程,包括剪切應力(shear stress),血中高膽固醇,以及葡萄糖和脂肪酸等代謝物都能對eNOS產(chǎn)生影響[4-7]。盡管已知內皮功能障礙部分是由NO產(chǎn)生受損引起的,但是eNOS本身的表達和活性調控相當復雜,其中的過(guò)程還未被充分認識。在基礎狀況下,大部分eNOS是結合在窖蛋白1(Cav1)上的,其活性中心被束縛在胞膜窖上,Cav1是胞膜窖中主要包被蛋白和組成部分[8]。對Cav1敲出小鼠的研究表明Cav1可能對出生后的動(dòng)物心血管功能至關(guān)重要,比如和內皮屏障功能,NO合酶的調節,膽固醇代謝和心臟功能等息息相關(guān)[9]。還有研究認為eNOS就是通過(guò)蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用,受到Cav-1的負調節[10,11]。
先前有報告顯示缺乏Cav-1的小鼠體型瘦小并能抵抗飲食對肥胖的誘導[12]。Cohen AW等人[13]進(jìn)一步揭示出這種瘦小體型的成因是由于缺少胰島素調控的脂肪合成。但是,據我們所知,尚未見(jiàn)在非遺傳學(xué)手段造成Cav1缺陷的動(dòng)物中,即在普通動(dòng)物中有高脂飲食誘導肥胖對心血管系統Cav1表達的研究,因此我們對高脂飲食誘導肥胖大鼠心血管Cav1表達和eNOS活性等進(jìn)行研究。
材料與方法
1.實(shí)驗動(dòng)物
雄性SD大鼠36只,體重160~170g,購自上海西普爾—必凱實(shí)驗動(dòng)物有限公司(準SCXK(滬)2003-0002)。各大鼠均單籠飼養,自由攝食、攝水,動(dòng)物房溫度(22±5)℃,相對濕度(50±10)%,明暗周期12比12,每周定時(shí)稱(chēng)體重。(1)肥胖模型制備[14]:購入大鼠適應性飼養1周后,按體重隨機抽取9只喂養基礎飼料作對照組(CF),其余27只大鼠喂以高脂飼料作試驗組。第15周時(shí),高脂實(shí)驗組大鼠體重基本穩定,體重大于對照組體重均值+1.96s的14只為DIO(肥胖)大鼠,體重小于對照組體重均值+1s的7只為DIOR(肥胖抵抗)大鼠。另有6只體重在肥胖敏感和肥胖抵抗之間,未進(jìn)入本次實(shí)驗研究。(2)低脂飲食干預實(shí)驗:DIO組再隨機分為2組,1組改為基礎飼料飲食(DIOHF/LF,7只),另一組維持高脂飲食(DIOHF,7只)。CF及DIOR大鼠仍維持原來(lái)飲食。繼續喂養8周。
2.飼料配方
基礎飼料由華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心提供,總熱能13.77kJ/g(蛋白質(zhì)21.88%、脂肪13.68%、碳水化合物64.44%);高脂飼料配制:100g含基礎飼料60g、豬油15g、雞蛋黃粉10g、脫脂奶粉8g、干酪素5g、白沙糖2g,總熱能19.33kJ/g(蛋白質(zhì)20.00%、脂肪49.85%、碳水化合物30.15%)。
3.組織樣品的準備
第23周實(shí)驗結束時(shí),過(guò)夜禁食10h后斷頭處死,分離腹腔內脂肪稱(chēng)重記錄,取胸主動(dòng)脈60mg左右,迅速置液氮冷凍,然后轉入-80℃超低溫冰箱以備Cav1的檢測。
4.主要試劑
Trizol試劑盒(Promega),RTPCR引物(北京奧科生物公司合成),BioRad DC蛋白定量試劑盒(BioRad),caveolin1兔抗(Sant Cruz),羊抗兔IgG(Sigma),αtubulin鼠抗(Sigma),羊抗鼠IgG(Sigma);ECL Plus顯影劑(Amersham Biosciences),寶麗來(lái)T667相紙(Polaroid),Biometra成像系統(Biometra),免疫組化試劑盒(中杉公司)。
5.血樣分析
實(shí)驗期間過(guò)夜禁食后于上午8時(shí)到12時(shí)之間采集尾靜脈血,所有樣品分析前置于-80℃超低溫冰箱。血糖濃度采用糖氧化法[15],血清總膽固醇和總甘油三脂分別用CHODPAP和GPOPAP法測定。
6.NOS活性
NOS活性用Griess反應測定[16],采用南京建成公司試劑盒。
7.免疫印跡[17]
冰凍保存的主動(dòng)脈組織取出后在三重細胞裂解液中勻漿,4℃離心(12000r/min×10min)提取蛋白上清液。用BioRad試劑盒進(jìn)行蛋白定量(Lowrys法),將蛋白量調成一致后加上樣緩沖液100℃變性5min,總蛋白上樣量為30μg,于12%SDSPAGE凝膠電泳2h,轉至硝酸纖維膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST4℃封閉過(guò)夜,分別與一抗和二抗孵育2h。Caveolin1一抗兔抗1∶200,二抗羊抗兔1∶6000;內參αtubulin一抗鼠抗1∶3000,二抗羊抗鼠1∶10000。與ECL顯影劑反應,于寶麗來(lái)成像系統曝光顯影于P667相紙,用掃描儀收集圖像,并用Biometra凝膠成像系統進(jìn)行圖像分析,Cav1蛋白表達水平用目的蛋白條帶光密度值與αtubulin條帶光密度值之比表示。
8.Cav-1mRNA的測定[18]
按Trizol說(shuō)明書(shū)從50mg主動(dòng)脈組織中提取總RNA。在25ul逆轉錄反應體系中,以1.0μg mRNA為模板將mRNA逆轉錄為cDNA。PCR反應以βactin作為內參照,βactin上游引物為5CAT CAC TAT CGG CAA TGA GC3,5GAC AGC ACT GTG TTG GCA TA3(156bp);caveolin1上游引物為5TCT ACA AGC CCA ACA ACA AGG3,下游引物為5AGG AAA GAG AGG ATG GCA AAG3(304bp)。RCR反應首先在95℃預變性5min,72℃延伸7min;95℃變性1min,55℃退火40s,72℃延伸40s,30個(gè)循環(huán);最后一次循環(huán)在72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳并與DNA標準分子量比較鑒定,用Biometra凝膠成像系統進(jìn)行成像和圖像分析,Cav1 mRNA表達水平用目的基因條帶光密度值與βactin條帶光密度值之比表示。
9.免疫組化[19]
主動(dòng)脈樣品于同濟醫院病理科行冰凍切片,丙酮固定10min后用3%H2O2孵育10min,在檸檬酸鈉中行抗原修復,羊血清封閉30min,加一抗(Anticaveolin1)4℃孵育過(guò)夜,加生物素化二抗孵育30min后,與辣根酶標記鏈霉卵白素(SA/HRP)反應30min,DAB顯色后蘇木素復染,封片后成像記錄。
10.統計學(xué)處理
全部數據錄入Microsoft Excel 2000,用SPSS 11.0統計軟件進(jìn)行統計分析,相關(guān)數據以x-±s表示,多個(gè)樣本均數間比較用方差分析。
結果
1.高脂飲食對大鼠體重和內臟脂肪的影響
統計結果顯示四組動(dòng)物的體重存在顯著(zhù)差異(F=18.846,P=0.000,Fig.1A),DIO大鼠(包括DIOHF和DIOLF)的平均體重明顯高于對照大鼠(P<0.01)或DR大鼠(P<0.01)。在飲食誘導期(實(shí)驗前15周),DIO大鼠體重增加明顯高于DR大鼠和普通飼料喂養的對照大鼠,DIO大鼠和對照之間體重的差異從第7周開(kāi)始出現一直維持到整個(gè)實(shí)驗結束(P<0.05),盡管從第15周后DIO大鼠換回到普通飼料,這種體重的差異仍然存在(DIOLF大鼠與對照大鼠相比,P<0.05)。盡管飲食上存在巨大差別,DR大鼠在整個(gè)實(shí)驗期間和對照組大鼠之間沒(méi)有發(fā)現體重上的差異。在實(shí)驗結束時(shí),DIOLF大鼠的體重低于DIOHF(P<0.05)但是高于DR大鼠的平均體重(P<0.05)。
在實(shí)驗結束時(shí),DIOHF大鼠的內臟脂肪分別顯著(zhù)高于對照組(P<0.05),DIOLF(P<0.05)和DR(P<0.05)大鼠(Fig.1B),但同時(shí)沒(méi)有觀(guān)察到DIOLF,DR和對照大鼠之間在內臟脂肪重量上的差異。
Fig.1Effects of highfat dietfed on body weight in male SpragueDawley rats.
The highfat dietfed rats were divided into three groups, namely, DIOLF(n=7),DIOHF(n=7),and DR(n=7) at the end of 15thweek according to the protocol in Materials and Methods.(A) Body weights were measured weekly and the data were presented as means SEM.Symbol (*) represents significant differences comparing with the control group (n=9) and different letters (a, b) attached to DIOLF group represents significant differences comparing with DIOHF and DR group, respectively(P<0.05).(B)White adipose tissue from visceral fat deposits were measured and wet weight was presented as means SEM.* P<0.05 compared with the bars indicated. DIOLF, highfat diet induced obesity rats shift back to lower fat normal chow diet; DIOHF,highfat diet induced obesity rats continue to be fed with highfat diet; DR, highfat diet resistance rats.
2.高脂飲食對大鼠血糖和血脂濃度的影響
如Fig.2A所顯示的:高脂飲食在飲食誘導結束時(shí)(即實(shí)驗第15周),以及整個(gè)實(shí)驗結束時(shí)(第23周),高脂飲食使DIO和DR大鼠的血糖均明顯升高(P<0.05,與對照大鼠相比)。換回到普通飼料使DIOLF大鼠的血糖回落到對照大鼠的水平(DIOLF和對照組相比,P>0.05)。雖然DIO大鼠(而非DR大鼠)的血膽固醇有升高的趨勢,但是沒(méi)有發(fā)現和對照大鼠血膽固醇之間有差異(Fig.2B)。至于血清甘油三脂水平,DIO大鼠(而非DR大鼠)明顯高于對照大鼠(P<0.05,Fig.2C),換回到普通飼料后,DIOLF大鼠的血清甘油三脂水平回落到和對照大鼠沒(méi)有差別的水平(P>0.05)。
Fig.2Serum glucose (A), cholestrol (B), and triglycerides (C) concentrations
in DIOLF, DIOHF, DIR and the control rats.
Values represent mean±SEM. Different letters (a,b,c) in Fig.2A represent significant differences of serum glucose in DIOHF, DIOLF and DR rats comparing with the control rats, respectively(P<0.05). Different letters (a,b,c) in Fig.2C represent significant differences of serum triglyceride in DIOHF rats comparing with the control, DIOLF and DR rats, respectively(P<0.05).
3.胸主動(dòng)脈NOS活性
我們對DIO,DR,和對照大鼠(n=5)的胸主動(dòng)脈中NOS活性進(jìn)行測定,各組動(dòng)物的NOS活性測定結果表明:DIO大鼠的總NOS(tNOS)和結構型NOS(cNOS)活性明顯低于對照組(P<0.05),但是沒(méi)有觀(guān)測到DR大鼠和對照大鼠之間存在差異(Fig.3)。
4.胸主動(dòng)脈Cav1 mRNA和蛋白表達
Cav1和胞膜窖在eNOS活性調節和膽固醇運輸方面起著(zhù)重要的作用,Cav-1水平的增減可以影響到胞膜窖的數目,進(jìn)而影響到eNOS的活性。因此我們對高脂飲食影響Cav-1水平進(jìn)行分析,結果顯示高脂飲食可以增加DIOHF大鼠的Cav1mRNA和蛋白表達水平(Fig.4A和Fig.4B),但在DR組大鼠中沒(méi)有發(fā)現這種調節作用,當DIO大鼠換回到普通飼料8周后,增加的Cav-1 mRNA或是蛋白表達都回復到對照組的水平(DIO-LF vs. DIO-HF, P<0.05;DIO-LF vs. Control,P>0.05)。
5.胸主動(dòng)脈Cav-1免疫組織化學(xué)分析
我們進(jìn)一步對對胸主動(dòng)脈中Cav1的分布進(jìn)行分析,Fig.5顯示所有各組對Cav1的免疫反應廣泛分布在胸主動(dòng)脈的整個(gè)橫斷面,其中DIOHF大鼠的染色比其它各組深,這表明高脂飲食誘導了大鼠胸主動(dòng)脈Cav1蛋白表達。這一結果和上述Western blot和RTPCR分析的結果是一致的。
Fig.4Effects of highfat diet on caveolin1 protein and mRNA expressions in thoracic aorta.
(A) Representative Western blot analysis of caveolin1 and alphatubulin proteins in thoracic aorta of rats. The bar graph represents four combined experiments. *p<0.05 compared with the bars indicated. (B) Representative RTPCR analysis of caveolin1 and betaactin mRNA in thoracic aorta of rats. The bar graph represents three combined experiments. *P<0.05 compared with the bars indicated.
Fig.5Immunohistochemistry for Cav1 in rat aorta.
Transversal sections of thoracic aorta from the control, DIO-LF, DIOHF and DR rats were immunolabeled with antibodies against caveolin1 and biotinylated secondary antibodies as described in Methods. 3, 3diaminobenzidinetetrahydrochloride was used to locate Cav1. Magnifications of indicated length are shown in each picture. The results are representative of three separate experiments.
6.胸主動(dòng)脈eNOS表達,eNOS(Ser 1177)和Akt1(Ser473)磷酸化
我們再對高脂飲食影響胸主動(dòng)脈eNOS表達和磷酸化狀況進(jìn)行分析。
Fig.6Effects of highfat diet and genetic nature on eNOS expressions,eNOS (Ser 1177) and Akt1 (Ser473) phosphorylations in thoracic aorta. (A)
Representative Western blot analysis of eNOS and alphatubulin proteins in thoracic aorta of rats . (B)the bar graph represent four combined experiments. *P<0.05 compared with the bars indicated. (C) Representative Western blot analysis of peNOS and pAkt1in thoracic aorta of rats.
Western blot結果顯示高脂飲食下調DIOHF組大鼠胸主動(dòng)脈eNOS表達,但在DR組大鼠中沒(méi)有發(fā)現類(lèi)似的變化(Fig.6A, DIOHF vs. Control, P<0.05)。另外,DIO大鼠換回到普通飼料8周后,這一作用消失(DIOLF vs. DIOHF, P<0.05 and DIFLF vs. Control, P>0.05)。在DIO組中(Fig.6B,包括DIOLF和DIOHF vs.對照組),胸主動(dòng)脈的eNOS(Ser 1177)和Akt1(Ser473)磷酸化水平均明顯提高。
討論
本部分研究的主要發(fā)現是:(1)高脂飲食增加大鼠胸主動(dòng)脈組織中Cav1表達,減少eNOS表達和活性;(2)換回到普通飼料可以恢復上述Cav1和eNOS的水平;(3)在飲食誘導抵抗大鼠(DR)中,高脂飲食喂養時(shí)未觀(guān)察到上述Cav1或eNOS表達的改變;(4)高脂飲食加強肥胖誘導大鼠胸主動(dòng)脈中eNOS(Ser 1177)和Akt(Ser473)磷酸化。
和人類(lèi)似,大鼠對于飲食誘導肥胖的敏感性有很大差人類(lèi)異,而肥胖誘導大鼠(DIO)表現出許多在人類(lèi)身上出現的肥胖綜合癥相關(guān)生理特點(diǎn)[20]。當一群雜交的SD(SpragueDawley)大鼠處于高脂飲食環(huán)境時(shí),各個(gè)體在體重增長(cháng)上表現出很大的差異,一部分動(dòng)物成為肥胖大鼠(DIO),而另一部分維持和低脂飲食喂養動(dòng)物相同的體重,即對飲食誘導肥胖產(chǎn)生抵抗(DR)[21]。人類(lèi)患糖尿病型血脂代謝異常或肥胖者常常可見(jiàn)到中血漿甘油三脂和脂肪酸升高的現象[22],有證據顯示高血糖和高血甘油三脂對動(dòng)脈管壁產(chǎn)生直接作用,能導致血管內皮功能障礙[23,24]。我們本部分研究中觀(guān)察到的甘油三脂和空腹血糖升高,也見(jiàn)于其他研究報道[25,26],但是,喂以高脂飲食的DR大鼠,其血中甘油三脂和膽固醇水平與普通飼料喂養的對照動(dòng)物之間未見(jiàn)有明顯的差異,類(lèi)似結果也見(jiàn)于Farley用高脂飲食研究(脂肪占能量的比例為45%)本[14],這種現象背后的機制尚不清楚,已有研究表明DR大鼠比DIO大鼠或對照大鼠血中含有更高濃度的PYY(peptide YY,一種小腸源性的食欲減退物質(zhì))[27]。這表明食欲控制的差別可能減低DR大鼠食物的攝入和體重的增加,在內分泌和脂肪代謝方面,對其中的差異進(jìn)行研究可能會(huì )得到一些有價(jià)值的線(xiàn)索。
在心血管系統中,內皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞和成纖維細胞都含有豐富的胞膜窖,在這些細胞中,胞膜窖在作為蛋白腳手架、細胞信號轉導、膽固醇和脂肪動(dòng)態(tài)平衡中起重要作用[28]。隨著(zhù)在內皮細胞漿膜面胞膜窖中確認有內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的存在,使胞膜窖中富集分子參與eNOS調節和信號轉導的認識得到新的關(guān)注[10,11]。有學(xué)者認為:在未受刺激的內皮細胞中,Cav1可能通過(guò)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間相互作用束縛eNOS活性。在Cav1缺失小鼠中乙酰膽堿刺激的血管舒張和NO依賴(lài)的微血管滲漏顯著(zhù)增強[29,30],這些結果都顯示Cav1抑制NO的合成。因此,改變Cav1的多少就可以調節eNOS活性,進(jìn)而調節血管功能。在本研究中,我們觀(guān)察了DIO大鼠主動(dòng)脈中Cav1 mRNA和蛋白水平呈現一致性地增加,可以認為這是由高脂飲食所致的結果,免疫組織化學(xué)分析的結果也支持了這一點(diǎn)。在DIO組大鼠中,無(wú)論是總NOS還是結構型NOS的活性都明顯降低,這也進(jìn)一步說(shuō)明高脂飲食導致的主動(dòng)脈Cav1高表達抑制了cNOS(其中主要是eNOS)的活性。和DIO大鼠相反的是,雖然同樣給予高脂飲食,在DR組大鼠中沒(méi)有觀(guān)察到Cav1水平、eNOS表達、以及NOS活性的改變,而且也沒(méi)有觀(guān)察到血糖以外的其它血液指標發(fā)生改變。綜合這些結果表明Cav1的調節不僅受高脂飲食的影響,遺傳背景造成的個(gè)體差異也在其中起到重要作用。原先有高脂飲食能增加豬冠狀動(dòng)脈Cav1表達的報道[31],也有對雌性Fischer大鼠主動(dòng)脈Cav1表達沒(méi)有影響的報道[32],在我們的研究中,證實(shí)了高脂飲食對Cav1的調節作用,而且我們還發(fā)現DIO大鼠回復到普通飼料后能使增加的Cav1水平恢復到對照組同樣的水平,這說(shuō)明了低脂的普通飲食的有利作用。
除了對Cav-1的調節作用,對eNOS表達和PI3K/Akt細胞信號通路及其下游eNOS磷酸化(ser 1177),對于NO的產(chǎn)生也是很重要的。Molnar等[33]還報道過(guò):是對eNOS雙聚體的破壞而不是損害胰島素介導的eNOS磷酸化,才是飲食誘導肥胖/患糖尿病小鼠內皮功能障礙的原因,不過(guò)從他們發(fā)表的Western blot結果來(lái)看,高脂飲食喂養的小鼠主動(dòng)脈還是有eNOS表達下降的現象。在我們研究中,高脂飲食降低了DIO大鼠主動(dòng)脈eNOS表達的同時(shí),還使蛋白激酶B(PKB/Akt)和eNOS磷酸化信號加強,這種作用不能通過(guò)回復到普通飼料加以改善。綜合這些結果和報道,表明高脂飲食調節NO產(chǎn)生有著(zhù)相當復雜的機制,可能存在多種機制共存的現象。
總之,高脂飲食加強Cav1表達,可能與肥胖個(gè)體心血管疾病危險性的增加有關(guān),其中至少部分原因是通過(guò)Cav1對eNOS的負調控有關(guān)。
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