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達能營(yíng)養中心第十屆學(xué)術(shù)研討會(huì )論文集

應晨江 楊年紅 許明佳 李彥榮 衣衛杰 劉烈剛 孫秀發(fā)
 
(華中科技大學(xué)公共衛生學(xué)院營(yíng)養與食品衛生學(xué)系,湖北武漢,430030)
 
摘要:目的窖蛋白1(Cav-1)是內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的負調節蛋白,影響到心血管功能的多個(gè)方面。本研究旨在了解高脂膳食對血管Cav-1表達和eNOS活性的影響。方法雄性SD大鼠隨機分為對照組和試驗組。試驗組用高脂飼料喂養15周,誘導肥胖(DIO)和肥胖抵抗(DR)后,再將DIO組大鼠一半改用基礎飼料飲食喂養干預(DIO-LF),另一半繼續維持高脂飲食(DIOHF)。對照組大鼠一直用基礎飼料喂養。第23周實(shí)驗結束時(shí)處死動(dòng)物,取主動(dòng)脈用RTPCR、免疫印跡及免疫組化方法檢測血管Cav-1表達水平,Griess試劑測定NOS活性,蛋白激酶B(PKB/Akt)磷酸化及eNOS表達和磷酸化通過(guò)免疫印跡檢測。結果(1)高脂膳食上調DIO大鼠主動(dòng)脈Cav-1蛋白表達,下調eNOS表達,在DR大鼠中未見(jiàn)到此作用;(2)DIO大鼠主動(dòng)脈中NOS活性下降,而DR大鼠中未見(jiàn)到此現象;(3)DIO大鼠(不論是DIOHF,還是DIO-LF)主動(dòng)脈中PKB/Akt、和eNOS(ser1177)磷酸化作用增強。結論本研究結果提示高脂飲食喂養大鼠主動(dòng)脈中NOS活性下降,至少部分是和Cav1表達增強有關(guān)。
關(guān)鍵詞:飲食誘導肥胖;內皮型一氧化氮合酶;窖蛋白1;蛋白激酶B
 
肥胖是引起心血管疾病最重要的危險因素之一[1]。但是其內在機制尚不十分清楚,有研究揭示出超重者中存在著(zhù)血管內皮功能失調的現象,并推測體內過(guò)量?jì)Υ娴闹疽l(fā)的代謝和炎癥反應可能涉及其中[2]。發(fā)現受損的內皮細胞功能遠早于血管異常的臨床表現和癥狀[3]。
健康的內皮有賴(lài)于一系列抗炎癥,抗纖維化,血管舒張功能的平衡,而這些平衡功能很大程度上需要一氧化氮(NO)來(lái)維持。在內皮中NO由內皮型NO合酶(eNOS)合成,許多生理病理過(guò)程,包括剪切應力(shear stress),血中高膽固醇,以及葡萄糖和脂肪酸等代謝物都能對eNOS產(chǎn)生影響[4-7]。盡管已知內皮功能障礙部分是由NO產(chǎn)生受損引起的,但是eNOS本身的表達和活性調控相當復雜,其中的過(guò)程還未被充分認識。在基礎狀況下,大部分eNOS是結合在窖蛋白1(Cav1)上的,其活性中心被束縛在胞膜窖上,Cav1是胞膜窖中主要包被蛋白和組成部分[8]。對Cav1敲出小鼠的研究表明Cav1可能對出生后的動(dòng)物心血管功能至關(guān)重要,比如和內皮屏障功能,NO合酶的調節,膽固醇代謝和心臟功能等息息相關(guān)[9]。還有研究認為eNOS就是通過(guò)蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用,受到Cav-1的負調節[10,11]。
 
先前有報告顯示缺乏Cav-1的小鼠體型瘦小并能抵抗飲食對肥胖的誘導[12]。Cohen AW等人[13]進(jìn)一步揭示出這種瘦小體型的成因是由于缺少胰島素調控的脂肪合成。但是,據我們所知,尚未見(jiàn)在非遺傳學(xué)手段造成Cav1缺陷的動(dòng)物中,即在普通動(dòng)物中有高脂飲食誘導肥胖對心血管系統Cav1表達的研究,因此我們對高脂飲食誘導肥胖大鼠心血管Cav1表達和eNOS活性等進(jìn)行研究。
 
材料與方法
1.實(shí)驗動(dòng)物
雄性SD大鼠36只,體重160~170g,購自上海西普爾—必凱實(shí)驗動(dòng)物有限公司(準SCXK(滬)2003-0002)。各大鼠均單籠飼養,自由攝食、攝水,動(dòng)物房溫度(22±5)℃,相對濕度(50±10)%,明暗周期12比12,每周定時(shí)稱(chēng)體重。(1)肥胖模型制備[14]:購入大鼠適應性飼養1周后,按體重隨機抽取9只喂養基礎飼料作對照組(CF),其余27只大鼠喂以高脂飼料作試驗組。第15周時(shí),高脂實(shí)驗組大鼠體重基本穩定,體重大于對照組體重均值+1.96s的14只為DIO(肥胖)大鼠,體重小于對照組體重均值+1s的7只為DIOR(肥胖抵抗)大鼠。另有6只體重在肥胖敏感和肥胖抵抗之間,未進(jìn)入本次實(shí)驗研究。(2)低脂飲食干預實(shí)驗:DIO組再隨機分為2組,1組改為基礎飼料飲食(DIOHF/LF,7只),另一組維持高脂飲食(DIOHF,7只)。CF及DIOR大鼠仍維持原來(lái)飲食。繼續喂養8周。
2.飼料配方
基礎飼料由華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心提供,總熱能13.77kJ/g(蛋白質(zhì)21.88%、脂肪13.68%、碳水化合物64.44%);高脂飼料配制:100g含基礎飼料60g、豬油15g、雞蛋黃粉10g、脫脂奶粉8g、干酪素5g、白沙糖2g,總熱能19.33kJ/g(蛋白質(zhì)20.00%、脂肪49.85%、碳水化合物30.15%)。
3.組織樣品的準備
第23周實(shí)驗結束時(shí),過(guò)夜禁食10h后斷頭處死,分離腹腔內脂肪稱(chēng)重記錄,取胸主動(dòng)脈60mg左右,迅速置液氮冷凍,然后轉入-80℃超低溫冰箱以備Cav1的檢測。
4.主要試劑
Trizol試劑盒(Promega),RTPCR引物(北京奧科生物公司合成),BioRad DC蛋白定量試劑盒(BioRad),caveolin1兔抗(Sant Cruz),羊抗兔IgG(Sigma),αtubulin鼠抗(Sigma),羊抗鼠IgG(Sigma);ECL Plus顯影劑(Amersham Biosciences),寶麗來(lái)T667相紙(Polaroid),Biometra成像系統(Biometra),免疫組化試劑盒(中杉公司)。
5.血樣分析
實(shí)驗期間過(guò)夜禁食后于上午8時(shí)到12時(shí)之間采集尾靜脈血,所有樣品分析前置于-80℃超低溫冰箱。血糖濃度采用糖氧化法[15],血清總膽固醇和總甘油三脂分別用CHODPAP和GPOPAP法測定。
6.NOS活性
NOS活性用Griess反應測定[16],采用南京建成公司試劑盒。
7.免疫印跡[17]
冰凍保存的主動(dòng)脈組織取出后在三重細胞裂解液中勻漿,4℃離心(12000r/min×10min)提取蛋白上清液。用BioRad試劑盒進(jìn)行蛋白定量(Lowrys法),將蛋白量調成一致后加上樣緩沖液100℃變性5min,總蛋白上樣量為30μg,于12%SDSPAGE凝膠電泳2h,轉至硝酸纖維膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST4℃封閉過(guò)夜,分別與一抗和二抗孵育2h。Caveolin1一抗兔抗1∶200,二抗羊抗兔1∶6000;內參αtubulin一抗鼠抗1∶3000,二抗羊抗鼠1∶10000。與ECL顯影劑反應,于寶麗來(lái)成像系統曝光顯影于P667相紙,用掃描儀收集圖像,并用Biometra凝膠成像系統進(jìn)行圖像分析,Cav1蛋白表達水平用目的蛋白條帶光密度值與αtubulin條帶光密度值之比表示。
8.Cav-1mRNA的測定[18]
按Trizol說(shuō)明書(shū)從50mg主動(dòng)脈組織中提取總RNA。在25ul逆轉錄反應體系中,以1.0μg mRNA為模板將mRNA逆轉錄為cDNA。PCR反應以βactin作為內參照,βactin上游引物為5CAT CAC TAT CGG CAA TGA GC3,5GAC AGC ACT GTG TTG GCA TA3(156bp);caveolin1上游引物為5TCT ACA AGC CCA ACA ACA AGG3,下游引物為5AGG AAA GAG AGG ATG GCA AAG3(304bp)。RCR反應首先在95℃預變性5min,72℃延伸7min;95℃變性1min,55℃退火40s,72℃延伸40s,30個(gè)循環(huán);最后一次循環(huán)在72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳并與DNA標準分子量比較鑒定,用Biometra凝膠成像系統進(jìn)行成像和圖像分析,Cav1 mRNA表達水平用目的基因條帶光密度值與βactin條帶光密度值之比表示。
9.免疫組化[19]
主動(dòng)脈樣品于同濟醫院病理科行冰凍切片,丙酮固定10min后用3%H2O2孵育10min,在檸檬酸鈉中行抗原修復,羊血清封閉30min,加一抗(Anticaveolin1)4℃孵育過(guò)夜,加生物素化二抗孵育30min后,與辣根酶標記鏈霉卵白素(SA/HRP)反應30min,DAB顯色后蘇木素復染,封片后成像記錄。
10.統計學(xué)處理
全部數據錄入Microsoft Excel 2000,用SPSS 11.0統計軟件進(jìn)行統計分析,相關(guān)數據以x-±s表示,多個(gè)樣本均數間比較用方差分析。
 
結果
1.高脂飲食對大鼠體重和內臟脂肪的影響
統計結果顯示四組動(dòng)物的體重存在顯著(zhù)差異(F=18.846,P=0.000,Fig.1A),DIO大鼠(包括DIOHF和DIOLF)的平均體重明顯高于對照大鼠(P<0.01)或DR大鼠(P<0.01)。在飲食誘導期(實(shí)驗前15周),DIO大鼠體重增加明顯高于DR大鼠和普通飼料喂養的對照大鼠,DIO大鼠和對照之間體重的差異從第7周開(kāi)始出現一直維持到整個(gè)實(shí)驗結束(P<0.05),盡管從第15周后DIO大鼠換回到普通飼料,這種體重的差異仍然存在(DIOLF大鼠與對照大鼠相比,P<0.05)。盡管飲食上存在巨大差別,DR大鼠在整個(gè)實(shí)驗期間和對照組大鼠之間沒(méi)有發(fā)現體重上的差異。在實(shí)驗結束時(shí),DIOLF大鼠的體重低于DIOHF(P<0.05)但是高于DR大鼠的平均體重(P<0.05)。
在實(shí)驗結束時(shí),DIOHF大鼠的內臟脂肪分別顯著(zhù)高于對照組(P<0.05),DIOLF(P<0.05)和DR(P<0.05)大鼠(Fig.1B),但同時(shí)沒(méi)有觀(guān)察到DIOLF,DR和對照大鼠之間在內臟脂肪重量上的差異。
Fig.1Effects of highfat dietfed on body weight in male SpragueDawley rats.
The highfat dietfed rats were divided into three groups, namely, DIOLF(n=7),DIOHF(n=7),and DR(n=7) at the end of 15thweek according to the protocol in Materials and Methods.(A) Body weights were measured weekly and the data were presented as means   SEM.Symbol (*) represents significant differences comparing with the control group (n=9) and different letters (a, b) attached to DIOLF group represents significant differences comparing with DIOHF and DR group, respectively(P<0.05).(B)White adipose tissue from visceral fat deposits were measured and wet weight was presented as means   SEM.* P<0.05 compared with the bars indicated. DIOLF, highfat diet induced obesity rats shift back to lower fat normal chow diet; DIOHF,highfat diet induced obesity rats continue to be fed with highfat diet; DR, highfat diet resistance rats.
 
2.高脂飲食對大鼠血糖和血脂濃度的影響
如Fig.2A所顯示的:高脂飲食在飲食誘導結束時(shí)(即實(shí)驗第15周),以及整個(gè)實(shí)驗結束時(shí)(第23周),高脂飲食使DIO和DR大鼠的血糖均明顯升高(P<0.05,與對照大鼠相比)。換回到普通飼料使DIOLF大鼠的血糖回落到對照大鼠的水平(DIOLF和對照組相比,P>0.05)。雖然DIO大鼠(而非DR大鼠)的血膽固醇有升高的趨勢,但是沒(méi)有發(fā)現和對照大鼠血膽固醇之間有差異(Fig.2B)。至于血清甘油三脂水平,DIO大鼠(而非DR大鼠)明顯高于對照大鼠(P<0.05,Fig.2C),換回到普通飼料后,DIOLF大鼠的血清甘油三脂水平回落到和對照大鼠沒(méi)有差別的水平(P>0.05)。
Fig.2Serum glucose (A), cholestrol (B), and triglycerides (C) concentrations
in DIOLF, DIOHF, DIR and the control rats.
Values represent mean±SEM. Different letters (a,b,c) in Fig.2A represent significant differences of serum glucose in DIOHF, DIOLF and DR rats comparing with the control rats, respectively(P<0.05). Different letters (a,b,c) in Fig.2C represent significant differences of serum triglyceride in DIOHF rats comparing with the control, DIOLF and DR rats, respectively(P<0.05).
3.胸主動(dòng)脈NOS活性
我們對DIO,DR,和對照大鼠(n=5)的胸主動(dòng)脈中NOS活性進(jìn)行測定,各組動(dòng)物的NOS活性測定結果表明:DIO大鼠的總NOS(tNOS)和結構型NOS(cNOS)活性明顯低于對照組(P<0.05),但是沒(méi)有觀(guān)測到DR大鼠和對照大鼠之間存在差異(Fig.3)。
4.胸主動(dòng)脈Cav1 mRNA和蛋白表達
Cav1和胞膜窖在eNOS活性調節和膽固醇運輸方面起著(zhù)重要的作用,Cav-1水平的增減可以影響到胞膜窖的數目,進(jìn)而影響到eNOS的活性。因此我們對高脂飲食影響Cav-1水平進(jìn)行分析,結果顯示高脂飲食可以增加DIOHF大鼠的Cav1mRNA和蛋白表達水平(Fig.4A和Fig.4B),但在DR組大鼠中沒(méi)有發(fā)現這種調節作用,當DIO大鼠換回到普通飼料8周后,增加的Cav-1 mRNA或是蛋白表達都回復到對照組的水平(DIO-LF vs. DIO-HF, P<0.05;DIO-LF vs. Control,P>0.05)。
5.胸主動(dòng)脈Cav-1免疫組織化學(xué)分析
我們進(jìn)一步對對胸主動(dòng)脈中Cav1的分布進(jìn)行分析,Fig.5顯示所有各組對Cav1的免疫反應廣泛分布在胸主動(dòng)脈的整個(gè)橫斷面,其中DIOHF大鼠的染色比其它各組深,這表明高脂飲食誘導了大鼠胸主動(dòng)脈Cav1蛋白表達。這一結果和上述Western blot和RTPCR分析的結果是一致的。
Fig.4Effects of highfat diet on caveolin1 protein and mRNA expressions in thoracic aorta.
(A) Representative Western blot analysis of caveolin1 and alphatubulin proteins in thoracic aorta of rats. The bar graph represents four combined experiments. *p<0.05 compared with the bars indicated. (B) Representative RTPCR analysis of caveolin1 and betaactin mRNA in thoracic aorta of rats. The bar graph represents three combined experiments. *P<0.05 compared with the bars indicated.
Fig.5Immunohistochemistry for Cav1 in rat aorta.
Transversal sections of thoracic aorta from the control, DIO-LF, DIOHF and DR rats were immunolabeled with antibodies against caveolin1 and biotinylated secondary antibodies as described in Methods. 3, 3diaminobenzidinetetrahydrochloride was used to locate Cav1. Magnifications of indicated length are shown in each picture. The results are representative of three separate experiments.
 
6.胸主動(dòng)脈eNOS表達,eNOS(Ser 1177)和Akt1(Ser473)磷酸化
我們再對高脂飲食影響胸主動(dòng)脈eNOS表達和磷酸化狀況進(jìn)行分析。
Fig.6Effects of highfat diet and genetic nature on eNOS expressions,eNOS (Ser 1177) and Akt1 (Ser473) phosphorylations in thoracic aorta. (A)
Representative Western blot analysis of eNOS and alphatubulin proteins in thoracic aorta of rats . (B)the bar graph represent four combined experiments. *P<0.05 compared with the bars indicated. (C) Representative Western blot analysis of peNOS and pAkt1in thoracic aorta of rats.
 
Western blot結果顯示高脂飲食下調DIOHF組大鼠胸主動(dòng)脈eNOS表達,但在DR組大鼠中沒(méi)有發(fā)現類(lèi)似的變化(Fig.6A, DIOHF vs. Control, P<0.05)。另外,DIO大鼠換回到普通飼料8周后,這一作用消失(DIOLF vs. DIOHF, P<0.05 and DIFLF vs. Control, P>0.05)。在DIO組中(Fig.6B,包括DIOLF和DIOHF vs.對照組),胸主動(dòng)脈的eNOS(Ser 1177)和Akt1(Ser473)磷酸化水平均明顯提高。
 
討論
本部分研究的主要發(fā)現是:(1)高脂飲食增加大鼠胸主動(dòng)脈組織中Cav1表達,減少eNOS表達和活性;(2)換回到普通飼料可以恢復上述Cav1和eNOS的水平;(3)在飲食誘導抵抗大鼠(DR)中,高脂飲食喂養時(shí)未觀(guān)察到上述Cav1或eNOS表達的改變;(4)高脂飲食加強肥胖誘導大鼠胸主動(dòng)脈中eNOS(Ser 1177)和Akt(Ser473)磷酸化。
和人類(lèi)似,大鼠對于飲食誘導肥胖的敏感性有很大差人類(lèi)異,而肥胖誘導大鼠(DIO)表現出許多在人類(lèi)身上出現的肥胖綜合癥相關(guān)生理特點(diǎn)[20]。當一群雜交的SD(SpragueDawley)大鼠處于高脂飲食環(huán)境時(shí),各個(gè)體在體重增長(cháng)上表現出很大的差異,一部分動(dòng)物成為肥胖大鼠(DIO),而另一部分維持和低脂飲食喂養動(dòng)物相同的體重,即對飲食誘導肥胖產(chǎn)生抵抗(DR)[21]。人類(lèi)患糖尿病型血脂代謝異常或肥胖者常常可見(jiàn)到中血漿甘油三脂和脂肪酸升高的現象[22],有證據顯示高血糖和高血甘油三脂對動(dòng)脈管壁產(chǎn)生直接作用,能導致血管內皮功能障礙[23,24]。我們本部分研究中觀(guān)察到的甘油三脂和空腹血糖升高,也見(jiàn)于其他研究報道[25,26],但是,喂以高脂飲食的DR大鼠,其血中甘油三脂和膽固醇水平與普通飼料喂養的對照動(dòng)物之間未見(jiàn)有明顯的差異,類(lèi)似結果也見(jiàn)于Farley用高脂飲食研究(脂肪占能量的比例為45%)本[14],這種現象背后的機制尚不清楚,已有研究表明DR大鼠比DIO大鼠或對照大鼠血中含有更高濃度的PYY(peptide YY,一種小腸源性的食欲減退物質(zhì))[27]。這表明食欲控制的差別可能減低DR大鼠食物的攝入和體重的增加,在內分泌和脂肪代謝方面,對其中的差異進(jìn)行研究可能會(huì )得到一些有價(jià)值的線(xiàn)索。
在心血管系統中,內皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞和成纖維細胞都含有豐富的胞膜窖,在這些細胞中,胞膜窖在作為蛋白腳手架、細胞信號轉導、膽固醇和脂肪動(dòng)態(tài)平衡中起重要作用[28]。隨著(zhù)在內皮細胞漿膜面胞膜窖中確認有內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的存在,使胞膜窖中富集分子參與eNOS調節和信號轉導的認識得到新的關(guān)注[10,11]。有學(xué)者認為:在未受刺激的內皮細胞中,Cav1可能通過(guò)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間相互作用束縛eNOS活性。在Cav1缺失小鼠中乙酰膽堿刺激的血管舒張和NO依賴(lài)的微血管滲漏顯著(zhù)增強[29,30],這些結果都顯示Cav1抑制NO的合成。因此,改變Cav1的多少就可以調節eNOS活性,進(jìn)而調節血管功能。在本研究中,我們觀(guān)察了DIO大鼠主動(dòng)脈中Cav1 mRNA和蛋白水平呈現一致性地增加,可以認為這是由高脂飲食所致的結果,免疫組織化學(xué)分析的結果也支持了這一點(diǎn)。在DIO組大鼠中,無(wú)論是總NOS還是結構型NOS的活性都明顯降低,這也進(jìn)一步說(shuō)明高脂飲食導致的主動(dòng)脈Cav1高表達抑制了cNOS(其中主要是eNOS)的活性。和DIO大鼠相反的是,雖然同樣給予高脂飲食,在DR組大鼠中沒(méi)有觀(guān)察到Cav1水平、eNOS表達、以及NOS活性的改變,而且也沒(méi)有觀(guān)察到血糖以外的其它血液指標發(fā)生改變。綜合這些結果表明Cav1的調節不僅受高脂飲食的影響,遺傳背景造成的個(gè)體差異也在其中起到重要作用。原先有高脂飲食能增加豬冠狀動(dòng)脈Cav1表達的報道[31],也有對雌性Fischer大鼠主動(dòng)脈Cav1表達沒(méi)有影響的報道[32],在我們的研究中,證實(shí)了高脂飲食對Cav1的調節作用,而且我們還發(fā)現DIO大鼠回復到普通飼料后能使增加的Cav1水平恢復到對照組同樣的水平,這說(shuō)明了低脂的普通飲食的有利作用。
除了對Cav-1的調節作用,對eNOS表達和PI3K/Akt細胞信號通路及其下游eNOS磷酸化(ser 1177),對于NO的產(chǎn)生也是很重要的。Molnar等[33]還報道過(guò):是對eNOS雙聚體的破壞而不是損害胰島素介導的eNOS磷酸化,才是飲食誘導肥胖/患糖尿病小鼠內皮功能障礙的原因,不過(guò)從他們發(fā)表的Western blot結果來(lái)看,高脂飲食喂養的小鼠主動(dòng)脈還是有eNOS表達下降的現象。在我們研究中,高脂飲食降低了DIO大鼠主動(dòng)脈eNOS表達的同時(shí),還使蛋白激酶B(PKB/Akt)和eNOS磷酸化信號加強,這種作用不能通過(guò)回復到普通飼料加以改善。綜合這些結果和報道,表明高脂飲食調節NO產(chǎn)生有著(zhù)相當復雜的機制,可能存在多種機制共存的現象。
總之,高脂飲食加強Cav1表達,可能與肥胖個(gè)體心血管疾病危險性的增加有關(guān),其中至少部分原因是通過(guò)Cav1對eNOS的負調控有關(guān)。
 
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