楊佳娟 白潔 胡科 王永超 馬文娟 羅瓊

(武漢大學(xué)公共衛生學(xué)院營(yíng)養與食品衛生學(xué)系，武漢，430071)

 

摘要：目的探討葡萄汁對人宮頸癌Hela細胞生長(cháng)與凋亡的影響及其機制。方法白藜蘆醇及不同濃度葡萄汁作用于宮頸癌Hela細胞48h；采用生長(cháng)曲線(xiàn)及噻唑藍（MTT）法檢測葡萄汁、白藜蘆醇對宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用；流式細胞儀檢測細胞凋亡峰；彗星實(shí)驗測定細胞的DNA鏈斷裂情況，分析DNA的損傷作用；檢測凋亡相關(guān)基因Bcl－2、Bax蛋白表達情況。結果本實(shí)驗設濃度為16、32、64μl/ml的葡萄汁隨濃度的增高，抑制人宮頸癌Hela細胞增殖作用明顯；DNA遷移長(cháng)度與彗星細胞拖尾率逐漸增高；誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡作用增強；誘導促凋亡基因Bax表達作用增強。32、64μl/ml葡萄汁組含白藜蘆醇濃度較白藜蘆醇組低，但作用強。結論葡萄汁可抑制人宮頸癌Hela細胞增長(cháng)，誘導其細胞凋亡，能上調促凋亡基因Bax的表達,下調抑凋亡基因Bcl2的表達，并且存在包括白藜蘆醇的各植物化學(xué)物間的交互作用。

關(guān)鍵詞：葡萄汁；白藜蘆醇；人宮頸癌Hela細胞；交互作用

 

Study on the effect of juice of grape on the apoptosis of

human cervical carcinoma Hela cellYang JiajuanBai JieHu KeWang YongchaoMa WenjuanLuo Qiong

(Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health，Wuhan University，Wuhan 430071)

 

Abstract:ObjectiveTo study the effect of juice of grape on the apoptosis of human cervical carcinoma Hela cell. MethodDifferent concentrations of juice of grape and resverotral were added to Hela cells which cultured in vitro. MTT assay was adopted to investigate the cytotoxic effect on Hela cel1. Single cell gel electrophoresis was used to measure the breakage of DNA strand of Helacell.Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry, and then the expression of apoptosis relative gene Bax was determined as well. ResultsIn this study , the concentrations(16、32、64μl／ml)of Juice of grape as the concentration of tomato juice high could inhibit obviously the proliferation of Hela cell;the length and rate of DNA tail were significantly higher; The apoptotic peaks were increased;the expression of Bax gene also increased. The effect of 32, 64μl／ml grape juice is stronger than that of the resverotral group while the content of resverotral is fewer than that of the positive group. ConclusionJuice of grape could inhibit the proliferation of Hela cel1 and induce apoptosis of Hela cell，which was related to the modulating of expression of Bax gene, and also make it sure that there is synergistical anticancer effect of phytochemicals.

Keywords: grape juice;resverotral; human cervical carcinoma Hela cell,synergistical effect

 

宮頸癌的發(fā)病率占我國女性生殖系統惡性腫瘤的首位，成顯著(zhù)增長(cháng)的趨勢,其發(fā)病年齡也在顯著(zhù)的年輕化。在臨床病理上，宮頸癌的發(fā)生是由子宮頸上皮內瘤變，原位癌，早期浸潤癌,浸潤癌的從量變到質(zhì)變的連續發(fā)展過(guò)程，其間歷經(jīng)10年或更長(cháng)的可逆轉癌前病變階段[1]。因此進(jìn)行宮頸癌的早期預防對于減少其發(fā)生和降低其危險性顯得極為重要。葡萄是一種世界性的水果，來(lái)源廣泛。其中富含的植物化學(xué)物單體白藜蘆醇，有研究表明能對人體具有抗多種癌細胞生長(cháng)增殖的生物學(xué)活性，藥用價(jià)值很大。除此之外，葡萄中還含有其他的植物化學(xué)物如原花青素、槲皮酮等，在保護人體健康的作用中也不可忽略。本研究旨在將葡萄制備成番茄汁，通過(guò)與植物化學(xué)物單體白藜蘆醇比較研究，探討葡萄汁對人宮頸癌Hela細胞生長(cháng)的作用及其可能機制，確認果汁中植物化學(xué)物交互作用的存在，為果蔬汁作為人類(lèi)便于接受、能長(cháng)期堅持飲用、并可以有效預防和輔助治療宮頸癌的飲品提供科學(xué)依據。

1對象和方法

1.1 研究對象

1.1.1 葡萄汁的制備：選用市售新疆成熟7~9月巨峰葡萄，洗凈后用雙蒸水沖洗三次，用紗布拭去表面水分，稱(chēng)重，勻漿壓榨出汁，六層紗布包裹擠汁，過(guò)濾除菌，得淡黃色葡萄汁，其汁中白藜蘆醇的含量按8mg/100ml計[2]。

1.1.2 白藜蘆醇：購于湖南省洪江華光生物有限責任公司，為純度99%標準品。

1.1.3 人宮頸癌Hela細胞株：購于武漢大學(xué)典藏中心，用在含10%新生牛血清的DMEM培養液中，于37℃，含5%CO2培養箱中培養。

1.2 實(shí)驗分組

實(shí)驗設6個(gè)組：

（1）空白對照組：僅含培養液；

（2）溶劑對照組：加入含PBS、0.5%DMSO的培養液；

（3）葡萄汁低劑量實(shí)驗組：終濃度為16μl/ml，白藜蘆醇的含量約為0.128μg/ml；

（4）葡萄汁中劑量實(shí)驗組：終濃度為32μl/ml，白藜蘆醇的含量約為0.256μg/ml；

（5）葡萄汁高劑量實(shí)驗組：終濃度為64μl/ml，白藜蘆醇的含量約為0.512μg/ml；

（6）陽(yáng)性對照組：白藜蘆醇用DMSO溶解后于培養液中的終濃度為4.56μg/ml。加入PBS使各組終體積一致，同時(shí)用飽和NaHCO3調節PH值。

1.3 細胞抑制實(shí)驗

取對數生長(cháng)期的Hela細胞接種于96孔培養板中（5×103/孔）培養24h，待細胞貼壁后加入不同濃度的葡萄汁、白藜蘆醇，總體積為每孔200μl，每一劑量設6個(gè)復孔，于48h后，每孔加入5mg/ml MTT 20μl繼續孵育4h，棄去培養液，每孔加入DMSO100μl，充分混勻振蕩10min，酶標儀在570nm處測吸光度值（A），實(shí)驗重復4次。計算平均A值和抑制率：抑制率（inhibitory rate, IR）=[（1－實(shí)驗組A值）／對照組A值]×100%。

1.4 彗星實(shí)驗

取對數生長(cháng)期的PC3細胞1×104個(gè)/ml接種于培養瓶培養24h，待細胞貼壁后加入不同濃度的番茄汁，葡萄汁，48小時(shí)后，消化離心，制備細胞懸液于PBS中，調濃度為1×106個(gè)/ml,用于彗星實(shí)驗。進(jìn)行制板，堿變性，電泳，中和，染色，并在熒光顯微鏡下觀(guān)察結果，每張片子隨機計數100個(gè)細胞，記錄拖尾細胞數，用目鏡測微尺隨機測量25個(gè)拖尾細胞的尾長(cháng)，并計算拖尾率（彗星細胞數/總細胞數）。

1.5 流式細胞儀分析細胞凋亡峰

細胞接種于6孔板中，12h后，加入不同濃度葡萄汁、白藜蘆醇作用48h，800r/min離心3min，棄上清液。用PBS洗滌1次，細胞沉淀用預冷的70%乙醇1ml在4℃固定24h。固定后的細胞用PBS洗滌2次，加入終濃度為50mg/L的RNaseA 37℃水浴30min，再加入PI染液至終濃度為50mg/L，進(jìn)行染色。300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，轉流式測量管。于FACSort流式細胞儀進(jìn)行細胞分析，在G0期左側的峰為凋亡峰。

1.6 凋亡相關(guān)基因Bcl－2、Bax蛋白表達的檢測

制作細胞爬片：以1×105/ml的細胞濃度接種于在6孔板中預置的無(wú)菌玻片上，經(jīng)作用48小時(shí)后取出，PBS洗滌2次，待干燥，冷丙酮固定10min后。按北京中山生物有限公司生產(chǎn)的Bcl－2、Bax蛋白試劑盒說(shuō)明方法進(jìn)行。胞漿中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細胞，隨機計數200個(gè)細胞，計算陽(yáng)性率＝（陽(yáng)性細胞/200）×100%。

1.7 統計分析

采用SPSS軟件包分析數據。用檢驗比較組間抑制率、細胞凋亡率、拖尾率及Bax陽(yáng)性細胞表達率。

2結果

2.1 葡萄汁與白藜蘆醇對Hela細胞生長(cháng)增殖

毒性的比較

溶劑與空白對照組的吸光度值相比差異無(wú)統計學(xué)意義(P＞0.05)，表明溶劑（PBS）對Hela細胞無(wú)抑制作用。葡萄汁低、中、高劑量組抑制率逐漸增高，表明隨葡萄汁劑量增大，抑制作用增強，存在著(zhù)劑量依賴(lài)關(guān)系。白藜蘆醇的抑制率居于中劑量組與低劑量組之間，與低、中劑量相比差異有統計學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明其也能抑制Hela細胞的增殖，且作用強于葡萄汁低劑量組，弱于葡萄汁中劑量組。結果見(jiàn)表1。

表1葡萄汁和白藜蘆醇對Hela細胞的增殖毒性作用(x-±S, n=4)

 

2.2 葡萄汁與白藜蘆醇對Hela細胞DNA鏈

斷裂情況的比較

熒光顯微鏡下觀(guān)察，空白、溶劑對照組的細胞為橘紅色圓形狀，無(wú)拖尾現象；空白對照組與溶劑對照組相比，細胞拖尾率及DNA遷移長(cháng)度差異無(wú)統計學(xué)意義(P＞0.05)。隨著(zhù)葡萄汁濃度增大，各劑量組彗星細胞拖尾現象愈明顯，且與對照組相比，差異有統計學(xué)意義(P＜0.01)，各劑量組之間的拖尾率有極顯著(zhù)性(P＜0.01)。葡萄汁低、中、高劑量組拖尾細胞DNA遷移長(cháng)度逐漸增加，且均高于對照組，其中中劑量組的DNA遷移長(cháng)度高于白藜蘆醇，差異有統計學(xué)意義(P＜0.05)。結果見(jiàn)表2。

 

表2葡萄汁及白藜蘆醇對Hela細胞DNA損傷影響的比較

2.3 葡萄汁與白藜蘆醇對Hela細胞凋亡影響的比較

圖1所示，葡萄汁低、中、高劑量及白藜蘆醇作用于人Hela細胞后均能出現亞二倍體凋亡峰，而對照組則無(wú)凋亡峰出現，表明葡萄汁與白藜蘆醇能誘導Hela細胞凋亡；其凋亡率分別是7.04%、27.20%、30.40%、12%，表明隨葡萄汁劑量增大，凋亡細胞增多，葡萄汁誘導Hela細胞凋亡的作用隨劑量增加而增強；葡萄汁低劑量組凋亡率與空白對照組（0.22%）相比，差異有極顯著(zhù)性(P＜0.01)；中劑量組葡萄汁與白藜蘆醇組比作用強，差異有顯著(zhù)性(P＜0.05)；實(shí)驗組凋亡率兩兩比較差異有顯著(zhù)性(P＜0.05)。

 

圖1葡萄汁與白藜蘆醇誘導Hela細胞凋亡

Fig.1Effect of grape juice and resverotral on

Apoptosis of Hela cells by flowcytometry

 

2.4 葡萄汁與白藜蘆醇對Hela細胞凋亡相關(guān)基因表達影響的比較

顯微鏡下可見(jiàn)，胞漿中明顯的黃棕色顆粒及黃染的細胞輪廓的Bcl2、Bax陽(yáng)性表達細胞，隨葡萄汁劑量的增加，Bax陽(yáng)性細胞數則明顯增多,但Bcl2陽(yáng)性細胞數明顯減少。由表3可知：葡萄汁低、中、高劑量組Bcl2陽(yáng)性表達率依次降低，Bax陽(yáng)性表達率依次增高，表明葡萄汁能通過(guò)上調促凋亡基因Bax的表達，下調抑凋亡基因Bcl2的表達來(lái)誘導Hela細胞凋亡。白藜蘆醇的Bax陽(yáng)性細胞率較番茄汁中劑量組低，而B(niǎo)cl2陽(yáng)性細胞率明顯增高，表明白藜蘆醇上調促凋亡基因Bax的表達，下調抑凋亡基因Bcl2的表達來(lái)誘導Hela細胞凋亡的能力較葡萄汁中劑量組弱。

 

表3葡萄汁及白藜蘆醇對Hela細胞凋亡相關(guān)基因、Bcl2表達的影響的比較

 

3討論

Imran等[3]研究10μM、25μM白藜蘆醇對人宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用和電離輻射增敏作用發(fā)現，兩種劑量的白藜蘆醇能連續7天抑制Hela的生長(cháng)增殖，能使細胞周期發(fā)生S期阻滯，并能增強HeLa細胞對電離輻射的毒性反應。朱振勤等[4]通過(guò)MTT及流式細胞儀分析白藜蘆醇作用后的HeLa細胞，結果表明白藜蘆醇能強烈抑制HeLa細胞增殖，并阻斷HeLa細胞由S期向G2期轉變而引起Hela細胞凋亡。Nakagawa等[5]報道白藜蘆醇能夠抑制3種人乳腺癌細胞株(KPL1，MCF7和MKLF)增殖，此增殖抑制與誘導細胞凋亡有關(guān)。除此之外，白藜蘆醇誘導人宮頸癌Hela凋亡的作用已經(jīng)有研究證實(shí)[3,4]。本研究以白藜蘆醇濃度4.560μg/ml為作為陽(yáng)性對照組，進(jìn)行體外培養發(fā)現白藜蘆醇能抑制人宮頸癌Hela細胞的增殖，調節Bcl－2和Bax基因的表達而誘導腫瘤Hela細胞的凋亡，從而起到了抗Hela細胞生長(cháng)的作用，與以上研究相吻合。

葡萄汁中不僅存有具抗癌作用的白藜蘆醇，還存有其他植物化學(xué)物如多酚類(lèi)等，Koki等[6]檢測發(fā)現在葡萄果汁中白葡萄汁的全酚含量為176mg/kg，紅葡萄汁的為206mg/kg。白藜蘆醇與其他物質(zhì)的交互的抗腫瘤作用，已早有研究。MertensTalcott等[7]研究表明葡萄中的鞣花酸、五羥黃酮與白藜蘆醇能協(xié)同抑制白血病細胞的生長(cháng)，并認為天然食物中的抗癌作用不是基于某一成分而是各成分的協(xié)同作用；Koichi Igura的實(shí)驗[8]表明五羥黃酮與白藜蘆醇能協(xié)同抑制淋巴瘤細胞的生長(cháng)；研究白藜蘆醇聯(lián)合5FU促進(jìn)人乳腺癌MCF7細胞凋亡的作用，發(fā)現白藜蘆醇與5FU合用可協(xié)同促進(jìn)MCF7細胞凋亡[9]。鄧紅等[10]觀(guān)察吐魯番無(wú)核白葡萄提取(10-1kg/L~10-6kg/L)對人宮頸癌細胞Hela生長(cháng)抑制作用的功效成分進(jìn)行檢測，發(fā)現其含的維生素C、多糖及黃酮含量分別為51.8mg/kg、68.1mg/kg及45.6mg/kg，提示其體外抑癌效果可能與所含有的維生素C、多糖及黃酮等成分有關(guān)。本研究以富含白藜蘆醇的葡萄汁作為受試物，作用于體外培養的Hela細胞時(shí)發(fā)現，在本實(shí)驗所設濃度范圍內，葡萄汁及白藜蘆醇均能抑制人宮頸癌Hela細胞的生長(cháng)增殖，并且隨濃度增加，增殖抑制作用增強；葡萄汁可能通過(guò)DNA損傷的發(fā)生，上調促凋亡基因Bax的表達而誘導Hela細胞凋亡產(chǎn)生增殖抑制作用，且白藜蘆醇組相比，葡萄汁中劑量組中所含的白藜蘆醇為0.256μg/ml，低于其數倍之多，但效果強；說(shuō)明葡萄汁中可能存在除白藜蘆醇外的其他物質(zhì)的交互抗癌作用，與以上研究相符。

本研究將含皮、籽的葡萄制成葡萄汁，發(fā)現其抗宮頸癌作用比高濃度的白藜蘆醇效果強，則原花青素、維生素C、其他多酚類(lèi)等物質(zhì)可能在其中發(fā)揮著(zhù)交互的抗腫瘤作用，但目前其交互抗腫瘤作用的機制仍未明了。

參考文獻

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