買(mǎi)淑鵬¹ 李曉山¹ 徐增光² 楊年紅¹

 

（1華中科技大學(xué)同濟醫學(xué)院公共衛生學(xué)院營(yíng)養與食品衛生系，武漢,430030;2同濟大學(xué)附屬東方醫院,上海,200120）

 

摘要:目的探討不同膳食模式對大鼠脂肪組織AMP激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase, AMPK）表達的影響及其對肥胖影響的機制。方法高脂飼料喂養雄性SD大鼠實(shí)驗組15周，按體重分為肥胖(DIO)和肥胖抵抗(DIOR)組，再將DIO組一半改用基礎飼料喂養(DIOHF/LF)，另一半繼續喂養高脂飲食(DIOHF)，DIOR組繼續喂養高脂飲食；以基礎飼料喂養組作對照(CF)。至第23周末過(guò)夜禁食處死動(dòng)物，取脂肪組織，用RTPCR方法檢測AMPKα1和AMPKα2mRNA表達水平，免疫印跡方法檢測AMPKα蛋白水平。結果DIOHF組大鼠體重顯著(zhù)高于CF、DIOHF/LF及DIOR組(P＜0.05)，DIOHF/LF組大鼠體重高于對照組(P＜0.05)。各組間AMPKα1mRNA表達均無(wú)差異（P＞0.05），DIOHF組AMPKα2mRNA表達及AMPKα蛋白水平顯著(zhù)低于CF、DIOHF/LF及DIOR組（P＜0.05），而其余各組之間差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。結論脂肪組織AMPKα水平降低與飲食誘導大鼠肥胖密切相關(guān)，其中AMPKα2扮演重要角色。

關(guān)鍵詞:AMP激活的蛋白激酶；脂肪組織；高脂飲食；肥胖；肥胖抵抗

 

研究表明，長(cháng)期高脂飲食可引起代謝紊亂，導致肥胖，而脂肪組織在能量代謝平衡方面起關(guān)鍵作用。AMP激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase, AMPK）是最近發(fā)現的一種調節能量代謝的重要蛋白，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是由α、β、γ3個(gè)亞基構成的異三聚體，其中α亞基是催化亞基，對AMPK的活性起主要作用[1]。本文擬通過(guò)建立飲食誘導大鼠肥胖模型，并對肥胖大鼠進(jìn)行不同的飲食干預，比較觀(guān)察各組大鼠脂肪組織中AMPKα基因和蛋白表達水平，以探討AMPK在飲食誘導肥胖中的作用及其對肥胖的影響機制。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗動(dòng)物及喂養

雄性SD大鼠36只，體重160～170g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗動(dòng)物有限公司。飼料配方及動(dòng)物飼養條件參照文獻[2]。大鼠適應性飼養1周后，按體重隨機抽取9只作對照組(CF)喂以基礎飼料，其余27只大鼠喂以高脂飼料，至第15周末，將高脂喂養組中體重大于對照組體重x-+1.96s者(14只)定為肥胖(DIO)大鼠，體重小于對照組體重x-+1.0s者(7只)定為肥胖抵抗(DIOR)大鼠。另有6只體重介于二者之間，未納入本次研究。DIO組再隨機分為2組，1組改喂基礎飼料飲食(DIOHF/LF)，另一組維持原高脂飼料(DIOHF)，CF及DIOR大鼠仍維持原飼料，各組繼續喂養8周，至第23周末過(guò)夜禁食處死。

1.2 實(shí)驗動(dòng)物相關(guān)指標觀(guān)察和組織樣品收集

每日觀(guān)察大鼠一般情況，記錄給食量和撒食量，計算進(jìn)食量，同時(shí)每周稱(chēng)體重。實(shí)驗結束時(shí)，過(guò)夜禁食l0h斷頭處死，分離腎周脂肪組織，迅速置液氮中凍存，以備RNA抽提，再分離睪周、腰周脂肪組織，稱(chēng)重。

1.3 RNA提取及逆轉錄—聚合酶鏈反應

(RTPCR)

按Trizol（Promega公司）說(shuō)明書(shū)從大鼠腎周脂肪組織提取總RNA，核酸蛋白測定儀測定RNA濃度，在25μl的反應體系中將3μg的RNA逆轉錄得到cDNA，進(jìn)行PCR擴增。AMPKα1（207bp）引物序列：sense：5attggatttccgaagtattgatg3, antisense：5cctggtcttggagctacgtca3，反應條件，95℃預變性5min，94℃ 1min，57℃ 45s，72℃ 1min，循環(huán)35次，72℃ 10min；AMPKα2（213bp）引物序列：sense：5aggtgtaccgagctatgaagca3，antisense：5agcgctgaggtgttgaagaac3，反應條件，95℃預變性5min，94℃ 1min，57℃ 45s，72℃ 1min，循環(huán)35次，72℃ 10min。βactin(156bp)引物序列：sense：5catcactatcggcaatgagc3，antisense：5gacagcactgtgttggcata3，反應條件，95℃預變性5min，94℃ 1min，59℃ 45s，72℃ 1min，循環(huán)35次，72℃ 10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳并與DNA標準分子量比較鑒定，用Biometra凝膠成像系統進(jìn)行成像和圖像分析，AMPKα1和AMPKα2mRNA表達水平用目的基因條帶分別與βactin條帶光密度值之比表示。

1.4 免疫印跡（Western blotting）

脂肪組織勻漿、離心提取蛋白上清液。用BioRad試劑盒蛋白定量(Lowry’s)法將蛋白水平調成一致，加上樣緩沖液100℃變性5min，于12％聚丙烯酰胺凝膠電泳2h15min，轉至硝酸纖維膜上。用5％脫脂奶粉室溫封閉2h，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1h后顯影成像分析。AMPKα一抗兔抗(美國Cell Signal Technology公司)1∶500，二抗羊抗兔（美國Sigma公司）1∶1500；內參αtublin一抗（美國Sigma公司）鼠抗1∶3000，二抗（美國Sigma公司）羊抗鼠1∶4000。AMPKα表達水平用目的基因條帶分別與αtublin條帶灰度值之比表示。

1.5 統計學(xué)處理

全部數據錄入Microsoft Excel 2003，用SPSS 12.0統計軟件進(jìn)行統計分析。數據以x-±s表示，多個(gè)樣本均數間的比較采用方差分析。

2結果

2.1 不同膳食對大鼠體重的影響

如圖1所示，高脂飼料喂養時(shí)DIO組大鼠與DIOR和CF大鼠之間的體重差異隨喂養時(shí)間增長(cháng)而逐漸增大，15周末，DIOHF/LF組與DIOR和CF間體重差異有統計學(xué)意義（P＜0.05），而DIOR和CF組間體重差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。低脂飲食干預8周期間，DIOHF/LF組體重增加低于其他各組，與DIOHF大鼠之間體重差異有統計學(xué)意義（P＜0.05），DIOR和CF組體重差異仍無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。第23周末，DIOHF組大鼠體重顯著(zhù)高于CF、DIOHF/LF及DIOR組(P＜0.05)，DIOHF/LF組大鼠體重高于對照組(P＜0.05)。

Fig.1The tendency of weight changes in different groups

 

2.2 各組大鼠脂肪蓄積能力比較

如表1所示，DIOHF組大鼠腎周、腰周、睪周脂肪濕重均顯著(zhù)高于CF、DIOHF/LF和DIOR組，三個(gè)部位總的脂肪濕重和脂體比也高于其他三組（P＜0.05），DIOR大鼠與對照組相比僅睪周和總的脂肪濕重有統計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 大鼠脂肪組織AMPKα mRNA表達水平

RTPCR結果顯示CF、DIOHF/LF、DIOHF及DIOR組AMPKα1mRNA表達的相對比值分別為0.86±0.21，1.11±0.23，0.95±0.38，0.86±0.12（見(jiàn)圖2），統計學(xué)結果顯示均無(wú)差異（P＞0.05），各組AMPKα2mRNA表達的相對比值分別為0.32±0.02，0.30±0.05，0.20±0.01，0.28±0.06（見(jiàn)圖3），DIOHF組顯著(zhù)低于DIOHF/LF、DIOR及CF組（P＜0.05），而其余3組之間差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。

 

Table 1Fat tissue deposits of different groups（x-±s）

Fig.3The expression of AMPKα2mRNA in adipose tissue of different groups

2.4 大鼠脂肪組織AMPKα蛋白水平

如圖4顯示，CF、DIOHF/LF、DIOHF及DIOR組AMPKα蛋白表達的相對比值分別為0.98±0.08，1.00±0.12，0.47±0.01，0.87±0.25，DIOHF組顯著(zhù)低于CF、DIOHF/LF及DIOR組（P＜0.05），而其余3組之間差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。

 

Fig.4The protein level of AMPKα in adipose tissue of different groups

 

3討論

AMPK是“細胞能量監測器”，在保持細胞內能量平衡方面扮演了重要角色。AMP/ATP比值增加可使AMPK激活（需要AMPK Thr172位的磷酸化），而AMPK的活化可抑制ATP合成代謝，促進(jìn)ATP分解代謝，如脂肪酸氧化[3]。目前對AMPK在肝臟和骨骼肌中的作用已有較多研究[4-8]。Watt等人報道，用飽和脂肪酸或多不飽和脂肪酸培養的L6骨骼肌肌管相對于對照組細胞增加了AMPK活性，同時(shí)，在脂肪酸干預過(guò)的細胞組促進(jìn)了AMPK Thr172位磷酸化，并分別增加了后續脂肪酸氧化[7]。與骨骼肌相似，在肝臟AMPK激活后，通過(guò)抑制乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的活性降低丙二酰輔酶A的濃度來(lái)抑制脂肪合成，促進(jìn)脂肪酸氧化[8]。關(guān)于脂肪組織的研究，Park等人觀(guān)察到自主運動(dòng)會(huì )引起脂肪組織中AMPK激活，從而促進(jìn)了脂肪酸氧化，同時(shí)ACC活性急劇下降[9]。本研究通過(guò)建立飲食誘導大鼠肥胖模型，并對肥胖大鼠進(jìn)行不同飲食干預后顯示：DIOHF組大鼠脂肪組織AMPKα2mRNA表達和AMPKα蛋白水平顯著(zhù)低于CF、DIOHF/LF及DIOR組，而大鼠體重和脂肪組織的蓄積能力DIOHF組顯著(zhù)高于CF、DIOHF/LF及DIOR組，提示脂肪組織中AMPK的低表達不利于脂肪酸氧化，促使了脂肪合成和肥胖的發(fā)生，脂肪組織中AMPK對脂質(zhì)代謝的機制很可能與其在肝臟和骨骼肌中扮演同樣的角色。

研究顯示，AMPKα2敲除小鼠與對照組小鼠相比，食物攝入量無(wú)差異的情況下，小鼠體重和脂肪組織的量均增加[10]，本次實(shí)驗研究結果顯示：DIOHF組與其它組相比AMPKα1和AMPKα2mRNA表達水平中僅AMPKα2mRNA表達下降，AMPKα1mRNA表達水平各組間并無(wú)差異，提示AMPKα2對脂肪組織的合成和代謝起著(zhù)至關(guān)重要的作用，脂肪組織AMPK對能量代謝平衡的作用主要是通過(guò)AMPKα2實(shí)現的，同時(shí)AMPKα2表達下降很可能是飲食誘導肥胖的機制之一。同時(shí)，本次實(shí)驗的研究結果還顯示，低脂飲食干預有助于改善大鼠體重增加量、脂肪蓄積量和脂肪組織AMPKα的表達，而大鼠肥胖抵抗可能與AMPKα表達維持正常有關(guān)。總之，脂肪組織AMPKα水平降低與飲食誘導大鼠肥胖密切相關(guān)，而它是否與其在肝臟和骨骼肌中發(fā)揮完全相同的作用及它對肥胖影響的具體機制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻

[1] Kahn BB, Alquier T, Carling D,et al. AMPactivated protein kinase: ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism[J]. Cell Metab, 2005,1:15-25.

[2] 王重建，楊年紅，許明佳，等.高脂飲食誘導大鼠肥胖易感性差異的研究.華中科技大學(xué)學(xué)報(醫學(xué)版)[J],2005,34(1)：65-68.

[3] Xue BZ, Kahn BB. AMPK integrates nutrient and hormonal signals to regulate food intake and energy balance through effects in the hypothalamus and peripheral tissues[J]. The Journal of Physiology, 2006,574:73-83.

[4] Martin TL, Alquier T, Asakura K, et al. Dietinduced Obesity Alters AMP Kinase Activity in Hypothalamus and Skeletal Muscle[J]. J. Biol. Chem,2006,281:18933-18941.

[5] Yamauchi T, Kamon J, Minokoshi Y, et al. Adiponectin stimulates glucose utilization and fattyacid oxidation by activating AMPactivated protein kinase[J]. Nature Medicine, 2002,8:1288-1295.

[6] Zhu MJ, Ford SP, Nathanielsz PW, et al. Effect of Maternal Nutrient Restriction in Sheep on the Development of Fetal Skeletal Muscle[J]. Biology of Reproduction,2004,71:1968-1973.

[7] Watt MJ, Steinberg GR, Chen ZP, et al. Fatty acids stimulate AMPactivated protein kinase and enhance fatty acid oxidation in L6 myotubes[J]. The Journal of Physiology, 2006,574:139-147.

[8] Assifi MM, Suchankova G, Constant S, et al. AMPactivated protein kinase and coordination of hepatic fatty acid metabolism of starved/carbohydraterefed rats[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2005, 289:E794-E800.

[9] Park H, Kaushik VK, Constant S, et al. Coordinate regulation of malonylCoA decarboxylase,snglycerol3phosphate acyltransferase, and acetylCoA carboxylase by AMPactivated protein kinase in rat tissues in response to exercise[J]. J Biol Chem, 2002,277:32571-32577.

[10] Villena JA, Viollet B, Andreelli F, et al. Induced adiposity and adipocyte hypertrophy in mice lacking the AMPactivated protein kinasealpha2 submit[J].Diabetes,2004,53:2242-2249.