達能營(yíng)養中心在全球
青年科學(xué)工作者論壇2008年第3期
《衛生研究》--2008年第三期 中國常用益生菌菌種的耐藥性研究
中國常用益生菌菌種的耐藥性研究
徐進(jìn) 劉秀梅 楊寶蘭 李志剛 姚景會(huì ) 余冬敏
中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所，北京 10021
摘要：采用肉湯稀釋法，對中國益生菌保健品行業(yè)常用的9株雙歧桿菌和22株乳桿菌，共計31株益生菌進(jìn)行了20種抗生素的耐藥性檢測。結果表明： 31株益生菌均對下列抗生素敏感：氨芐西林、青霉素、亞胺培南、慶大霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、加替沙星、紅霉、素克林霉素、四環(huán)素、利福平和頭孢噻肟；而對萘啶酮酸、萬(wàn)古霉素和磷霉素的耐藥率較高。
關(guān)鍵詞：益生菌 耐藥性
Antimicrobial Susceptibility of Probiotics
Xu Jin, Liu Xiumei, Yao Baolan, Li Zhigang, Yao jinghui, Yu Dongmin
National Institute of Nutrition and Food Safety, China Center for Control and Prevention, Beijing 100021, China
Abstract: The aim of our study was to analyse the antibiotic susceptibility of 31 probiotics strains, including 9 Bifidobacterium and 22 Lactobacillus used for the manufacture of various fermented foods in China. Probiotics are tested for minimum inhibitory concentrations(MIC) of 20 kinds of antibiotics by broth dilution method on cation-adjusted Mueller-Hinton broth with lysed horse blood. 31 strains of probiotics were sensitive to ampicillin ,penicillin ,imipenem ,gentamicine, amoxicillin, amoxicillin/clavulanic acid ,gatifloxacin , erythromycin , clindamycin, and resistant to nalidixic acid, vancomycine , fosfomycin.
Key words: Probiotics, Antibiotic Susceptibility Testing
2002年FAO／WHO(Food and Agriculture Organization/World Health Organization)聯(lián)合專(zhuān)家組提出了《用于食品的益生菌安全性評價(jià)指導原則》，原則指出益生菌是指活的微生物，當人體攝入足夠量的時(shí)候可對人體產(chǎn)生有益的作用。通常所說(shuō)的益生菌主要就是指乳桿菌和雙歧桿菌等乳酸菌，這些益生菌廣泛應用于發(fā)酵食品中，如酸奶、乳酪，或者將益生菌直接制成菌粉食用。
傳統的益生菌菌種，比如嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在安全應用上已有很長(cháng)的歷史，被認為是沒(méi)有致病可能性的共生微生物體。但目前新的益生菌菌種不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)進(jìn)入市場(chǎng)，這些新菌種能否分享傳統菌種的安全性，目前引起國外專(zhuān)家的極大爭論。鑒于此，FAO／WHO在《用于食品的益生菌安全性評價(jià)指導原則》中指出益生菌存在的可能危害包括：①益生菌進(jìn)入血液引起的人體全身性感染（菌血癥和感染性心內膜炎）；②益生菌產(chǎn)生有害的代謝活性產(chǎn)物對人體產(chǎn)生的不良反應；③食用益生菌制劑后對敏感個(gè)體的免疫刺激作用；④益生菌菌種在長(cháng)期使用后所攜帶耐藥基因的轉移。由益生菌引起的菌血癥，產(chǎn)生的有害代謝活性產(chǎn)物和個(gè)體免疫刺激作用發(fā)生率非常低，而某些益生菌對抗生素具有天然的耐藥性，所以目前益生菌的安全性問(wèn)題主要集中在由益生菌所攜帶耐藥基因轉移引起的耐藥性問(wèn)題，益生菌菌株的耐藥性評價(jià)時(shí)目前國際上益生菌安全評價(jià)的首要內容。本文采用肉湯稀釋法，對2005~2006年在中國保健品市場(chǎng)常用的22株乳桿菌和9株雙歧桿菌的耐藥性進(jìn)行了分析，初步評估中國目前所使用的益生菌的耐藥狀況，為中國益生菌的安全性評估提供技術(shù)依據。
1 材料與方法：
1.1材料：益生菌為中國保健食品行業(yè)常用菌種，包括9株雙歧桿菌（Bifidobacterium）和22株乳桿菌（Lactobacillus）。
1.2益生菌菌種藥物敏感性試驗
采用美國Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)推薦的96微孔肉湯稀釋法，培養基為金屬離子調整的MH培養基（Mueller-Hinton Agar）加裂解的馬血（2.5~5% v/v）[1]。96微孔耐藥板及抗生素濃度的制備由天津金章公司提供。質(zhì)控菌株為CLSI推薦的Streptococcus pneumoniae ATCC49619。使用的抗生素（OXOID，英國）種類(lèi)及濃度范圍見(jiàn)表1。
表1 本實(shí)驗使用的抗生素及其濃度范圍
Table 1 Antibiotics used in this study
|
序號
|
抗生素名稱(chēng) |
中文
|
濃度(μg/ml)
|
|
1
|
Ampicillin
|
氨芐西林
|
0.016-256
|
|
2
|
Penicillin
|
青霉素
|
0.016-256
|
|
3
|
Imipenem
|
亞胺培南
|
0.016-256
|
|
4
|
Gentamicine
|
慶大霉素
|
0.016-256
|
|
5
|
Vancomycine
|
萬(wàn)古霉素
|
0.016-256
|
|
6
|
Erythromycin
|
紅霉素
|
0.016-256
|
|
7
|
Clindamycin
|
克林霉素
|
0.016-256
|
|
8
|
Trimethoprin/sulfamethoxazone
|
甲氧芐胺嘧啶/磺胺甲基異噁唑
|
0.002-32
|
|
9
|
Amoxicillin
|
阿莫西林
|
0.016-256
|
|
10
|
Amoxicillin/clavulanic acid
|
阿莫西林/棒酸
|
0.016-256
|
|
11
|
Gatifloxacin
|
加替沙星
|
0.016-256
|
|
12
|
Ciprofloxacin
|
環(huán)丙沙星
|
0.002-32
|
|
13
|
Chloramphenicol
|
氯霉素
|
0.016-256
|
|
14
|
Streptomyxine
|
鏈霉素
|
0.016-256
|
|
15
|
Tetracycline
|
四環(huán)素
|
0.016-256
|
|
16
|
Fosfomycin
|
磷霉素
|
0.016-256
|
|
17
|
Kanamycine
|
卡那霉素
|
0.016-256
|
|
18
|
Nalidixic acid
|
萘啶酮酸
|
0.016-256
|
|
19
|
Ceftriaxone
|
頭孢曲松
|
0.016-256
|
|
20
|
Cephalothin
|
頭孢噻吩
|
0.016-256
|
|
21
|
Cefepime
|
頭孢吡肟
|
0.016-256
|
|
22
|
Norfloxacine
|
諾氟沙星
|
0.016-256
|
|
23
|
Rifampin
|
利福平
|
0.016-256
|
|
24
|
Cefotaxime
|
頭孢噻肟
|
0.016-256
|
2、藥物敏感性試驗結果:
本試驗益生菌菌種對不同抗生素的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentrations , MIC）范圍見(jiàn)表2。
表2 益生菌菌種對不同抗生素的最低抑菌濃度（MIC）范圍(μg/ml)
Table 2 Minimum inhibitory concentrations of Probiotics to different antibiotics
|
抗生素
|
耐藥判定標準的MIC值
|
乳桿菌（22株）
|
|
雙歧桿菌 （9株）
|
||
|
MIC范圍
|
敏感率（%）
|
|
MIC范圍
|
敏感率（%）
|
||
|
氨芐西林
|
≥8 （3）
|
0.016-1
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
青霉素
|
≥8 （3）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
亞胺培南
|
≥0.5 （3）
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
慶大霉素
|
≥16 （3）
|
0.016-2
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
阿莫西林
|
≥8（2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
阿莫西林/棒酸
|
≥8 （2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-0.5
|
100.00
|
|
加替沙星
|
≥4 （2）
|
0.016-1
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
紅霉素
|
≥8（3）
|
0.016-0.25
|
100.00
|
|
0.5-0.016
|
100.00
|
|
克林霉素
|
≥8 （2）
|
0.016-0.5
|
100.00
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
四環(huán)素
|
≥8 （2）
|
0.016-4
|
100.00
|
|
0.016-16
|
100.00
|
|
利福平
|
≥4 （2）
|
0.016-2
|
100.00
|
|
0.016-2
|
100.00
|
|
頭孢噻肟
|
≥32 （2）
|
0.016-8
|
100.00
|
|
0.125-4
|
100.00
|
|
鏈霉素
|
≥16 （2）
|
0.016-16
|
95.45
|
|
0.016-8
|
100.00
|
|
頭孢噻吩
|
≥32 （1）
|
0.125-64
|
90.91
|
|
0.125-64
|
77.78
|
|
氯霉素
|
≥4 （2）
|
0.012-4
|
90.91
|
|
0.016-4
|
100.00
|
|
環(huán)丙沙星
|
≥4（1）
|
0.016-8
|
81.82
|
|
0.016-16
|
100.00
|
|
諾氟沙星
|
≥16 （2）
|
0.125-128
|
77.27
|
|
2-64
|
66.67
|
|
甲氧芐胺嘧啶/磺胺甲基異噁唑
|
≥4 （2）
|
0.016-32
|
72.27
|
|
0.016-32
|
66.67
|
|
卡那霉素
|
≥16 （2）
|
0.5-64
|
68.18
|
|
0.0312-64
|
88.89
|
|
頭孢曲松
|
≥32 （1）
|
0.0625-32
|
63.64
|
|
0.0312-16
|
100.00
|
|
頭孢吡肟
|
≥32 （1）
|
0.0312-128
|
54.55
|
|
0.016-32
|
100.00
|
|
磷霉素
|
≥32 （1）
|
0.125-256
|
31.82
|
|
0.016-256
|
66.67
|
|
萬(wàn)古霉素
|
≥32 （3）
|
0.25-256
|
27.27
|
|
0.016-256
|
66.67
|
|
萘啶酮酸
|
≥32（1）
|
128-256
|
0.00
|
|
1-256
|
33.33
|
注：（1）Scientific committee on animal nutrition (SCAN) [9]；
（2）本試驗判定標準[2,3]；
（3）CLSI[1] ；
由表2可見(jiàn)，22株乳桿菌和9株雙歧桿菌有相似的耐藥譜，乳桿菌對本實(shí)驗所選用的抗生素的耐藥性要高于雙歧桿菌。22株乳桿菌和9株雙歧桿菌均對下列抗生素敏感：氨芐西林、青霉素、亞胺培南、慶大霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、加替沙星、紅霉、素克林霉素、四環(huán)素、利福平和頭孢噻肟。22株乳桿菌對萘啶酮酸、萬(wàn)古霉素和磷霉素的耐藥性較高，分別為100%，72.63%和68.18%。
3、討論
益生菌安全性一個(gè)非常重要的方面是其耐藥性。本研究結果顯示，22株乳桿菌和9株雙歧桿菌有相似的耐藥譜。在2005年檢測的中國常用發(fā)酵乳制品的12株益生菌中，耐藥的主要模式為丁胺卡那霉素-卡那霉素-萘啶酮酸-復方新諾明-甲氧芐胺嘧啶-萬(wàn)古霉素[4]，和本次實(shí)驗的結果相似。從國內外資料來(lái)看，益生菌均耐受多種抗生素。Katla 等對挪威市場(chǎng)的189株乳酸菌的耐藥檢測結果表明[5]：189株乳酸菌均對下列抗生素敏感：氨芐西林、青霉素G、頭孢噻吩、萬(wàn)古霉素、桿菌肽、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星。Temmerman等對歐洲益生菌產(chǎn)品市場(chǎng)分離到的187株益生菌的耐藥檢測表明[6]：對卡那霉素，萬(wàn)古霉素、四環(huán)素、青霉素G、紅霉素和氯霉素的耐藥率分別為79%、65%、26%、23%、16%和11%，68.4%的菌株具有多重耐藥特性。Lim等對韓國市場(chǎng)37株雙歧桿菌的耐藥檢測結果表明[7]：大部分雙歧桿菌耐受頭孢噻吩、卡那霉素、新霉素、萘啶酮酸和多黏菌素B，部分雙歧桿菌耐受慶大霉素和鏈霉素。Masco等對比利時(shí)市場(chǎng)100株乳酸菌的耐藥檢測結果表明[8]：所有菌株均對阿莫西林、氯霉素、紅霉素和萬(wàn)古霉素敏感；其中11株雙歧桿菌均耐受慶大霉素和多年菌素B。綜合國內與國際資料來(lái)看，無(wú)論是乳桿菌還是雙歧桿菌，萘啶酮酸和卡那霉素的耐藥率較高，其他抗生素的結果則有很大差異，不同的益生菌菌種顯示了各自復雜的耐藥特性。這主要是因為，2007年CLSI才出版了乳酸菌耐藥試驗的標準[1]，在此之前由于各實(shí)驗室所采用的培養基，使用的抗生素，檢測的方法和質(zhì)控菌株不同，使得不同試驗室間的數據也不同。本研究所采用的方法為2007年CLSI出版的乳酸菌耐藥試驗的標準。
對益生菌耐藥性的管理上不同國家及國際組織也不盡相同。美國FDA對益生菌的耐藥性沒(méi)有特別規定，把益生菌類(lèi)發(fā)酵食品作為GRAS (generally recognized as safe)級來(lái)看待，需要明確的是美國FDA并不是將益生菌菌株本身做為GRAS 來(lái)看待，而是指益生菌發(fā)酵的食品。益生菌及其制品在歐洲使用歷史悠久并銷(xiāo)量巨大，因此歐盟食品安全局提出了Qualified Perception of Safety(QPS)概念[9]。其內涵是既不等同于有長(cháng)期使用歷史的益生菌就是安全的觀(guān)點(diǎn)，也不能將益生菌的安全性評價(jià)規定的過(guò)于嚴格而阻礙益生菌的市場(chǎng)發(fā)展，就益生菌的耐藥性而言，規定益生菌不得攜帶可轉移的耐藥基因。中國的益生菌評審機構目前尚未對益生菌耐藥性作出明確的規定。從歐盟食品安全局對益生菌安全性的管理來(lái)看，如何評價(jià)益生菌的耐藥特性對人群健康的影響將是對益生菌進(jìn)行危險性評估最重要的內容之一。
5 參考文獻
1. JAMES H，Janet HINDER， et al. Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or Fastidious Bacreria[M] .Clinical and laboratory standards institute..2007,26(19):24-25.
2. ANJA S. Hummel, Christian Hertel, et al. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of Lactic acid bacteria[J]. Applied and Environment Microbiology, 2007, 73(3):730-739.
3. MOUBARECK C, GAVINI F, et al. Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005(1)38-44.
4. 徐進(jìn),劉秀梅. 國內保健食品常用益生菌株的耐藥性分析[J]. 中國食品衛生雜志, 2005,17（2）:108-112.
5. KATLA AK, KRUSE H, et al. Antimicrobial susceptibility of starter culture bacteria used in Norwegian dairy products[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001;67(1-2):147-52.
6. TEMMERMAN R, SWINGS J, et al. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products[J]. International Journal of FoodMicrobiology, 2003; 81(1):1-10.
7. LIM K S , HUH S C, et al. Antimicrobial Susceptibility of Bifidobacteria[J]. Journal Dairy Science, 1993,76:2168-2174.
8. MASCO L, HOORDe K Van, et al. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products [J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005:185-94.
9. European food safety authority. Scientific committee on animal nutrition on the criteria for assessing the micro-organisms resistant to antibiotics of human clinical and veterinary importance. revised on 24 January 2003.