達能營(yíng)養中心在全球
青年科學(xué)工作者論壇2008年第3期
《衛生研究》--2008年第三期 孕晚期母親不同鐵狀態(tài)下胎盤(pán)Ferroportin1的表達
調查研究
孕晚期母親不同鐵狀態(tài)下胎盤(pán)Ferroportin1的表達
李燕琴 顏虹 ，* 白斌1，張倩2
西安交通大學(xué)醫學(xué)院公共衛生系，710061
摘 要 目的：為進(jìn)一步理解FP1在人胎盤(pán)鐵輸出中的作用，對母親不同鐵營(yíng)養狀態(tài)下胎盤(pán)ferroportin1 (FP1)的蛋白表達、定位及其mRNA表達的變化進(jìn)行了測定。方法：臨床選擇不同鐵營(yíng)養狀態(tài)的孕婦，收集分娩時(shí)的胎盤(pán)。采用免疫組織化學(xué)方法測定FP1蛋白的定位，Western Blot測定蛋白表達量的變化，mRNA表達測定采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR。結果：結果顯示FP1蛋白主要表達在人足月胎盤(pán)的合體滋養細胞（STB）胞漿；母親不同鐵營(yíng)養狀態(tài)下胎盤(pán)FP1蛋白和mRNA 的表達均無(wú)明顯變化。結論：研究結果提示胎盤(pán)FP1的表達可能有多種調節機制。除了FP1外，可能還有其它的因子直接或間接參與胎盤(pán)的鐵輸出。
關(guān)鍵詞：胎盤(pán) 鐵轉運 ferroportin1
中圖分類(lèi)號： 文獻標識碼：
Expression of Ferroportin1Within Human Term Placentas from Different Maternal Iron Status
Li Yan-qin1，Yan Hong1，*，Bai Bin2，Zhang Qian3
1 Faculty of Public Health, Xi'an Jiaotong University School of Medicine, Xi'an, Shaanxi Province 710061
2 The First Affiliated Hospital of the School of Medicine, Xi'an Jiaotong University, Xi'an, Shaanxi Province 710061
3 The 630 Hospital of Yan-liang, Xi'an, Shaanxi Province 710089
Abstract: Objective To better understand the role of ferroportin1 (FP1) in human placental iron efflux, the protein and mRNA expression of FP1 within human term placenta were examined.
Methods Forty human term placentas were collected from pregnant women with different degree of maternal iron deficiency. The localization of FP1 protein within the placenta was showed by immunohistochemical staining. The protein and mRNA expression of FP1 were assessed by means of Western Blot and real-time quantitative RT-PCR. Results The study showed that there is no significant change for FP1 expression at both protein and mRNA levels among different maternal iron status. FP1 staining was detected in the placental syncytiotrophoblast (STB) cells and distributed predominantly in the cytoplasm. Conclusion Both protein and mRNA expression of FP1 within human term placentas showed no significant change with different degree of maternal iron status. It indicated that the expression of FP1 protein in human placenta was probably regulated by several mechanisms. And there might be other proteins involved in the placental iron efflux directly or indirectly besides FP1.
Key words: placenta; iron transfer; ferroportin1
孕育中的胎兒也需要大量的鐵來(lái)滿(mǎn)足自身生長(cháng)發(fā)育的需要，胎兒所需的鐵完全來(lái)自母體供給。母體的鐵向胎兒的轉運是通過(guò)胎盤(pán)介導的單向(從母體到胎兒)、逆濃度梯度（主動(dòng)的）的轉運過(guò)程，但胎盤(pán)鐵輸出的分子機制至今尚未闡明。作為至今為止發(fā)現的唯一一個(gè)直接參與細胞鐵輸出的蛋白[1]，2000年發(fā)現的跨膜鐵輸出蛋白Ferroportin1 (FP1，MTP1，IREG1)[2, 3]為進(jìn)一步研究胎盤(pán)鐵輸出的分子機制提供了重要的線(xiàn)索。初步研究表明，FP1可能在鐵從母體到胎兒的轉運中起著(zhù)重要作用，但尚無(wú)明確的結論。為進(jìn)一步理解FP1在胎盤(pán)鐵輸出中的作用，本研究同時(shí)測定了母親不同鐵營(yíng)養狀況下胎盤(pán)FP1蛋白表達、定位及其mRNA表達的變化。
2 材料與方法
2.1 對象
在西安交通大學(xué)醫學(xué)院第一附屬醫院分娩的基本健康的孕婦，尤其注意排除合并母親心血管疾病、代謝性疾病、血液疾病、高血壓、糖尿病等可能影響胎盤(pán)鐵轉運的孕婦，排除慢性病貧血和溶血性貧血，將患有不同程度貧血的孕婦順序納入。本研究得到西安交通大學(xué)醫學(xué)倫理委員會(huì )的同意，分娩前取得了孕婦的知情同意。共納入孕婦40名。
分娩前采孕婦的靜脈血，用自動(dòng)血液生化檢測儀進(jìn)行血常規檢測，獲得血紅蛋白（Hb）等血液學(xué)指標。孕晚期貧血的診斷采用WHO推薦的標準，即Hb<110g/L而且紅細胞壓積 (Hct) < 33.0%。根據母親Hb水平將研究對象分為3組：非貧血組(Hb≥110g/L)，輕度貧血組(90 g/L≤Hb <110 g/L) 和中度貧血組(Hb <90 g/L)。
2.2 胎盤(pán)組織收集
胎盤(pán)娩出后快速剪取小塊的胎盤(pán)組織，所有接觸胎盤(pán)的材料均預先經(jīng)滅RNA酶處理。首先取多個(gè)小塊絨毛組織用DEPC水快速沖洗血液，然后放入無(wú)RNA酶的EP管中迅速投入液氮里，后放入-80°C冰箱保存備用。另切取從母面到胎兒面的全層胎盤(pán)組織（約1×1×2cm3）簡(jiǎn)單用無(wú)菌生理鹽水沖洗血液后放入4%多聚甲醛中固定。
2.3 免疫組織化學(xué)染色
固定在4%多聚甲醛的胎盤(pán)組織經(jīng)一系列梯度酒精脫水，二甲苯以及石蠟包埋等標準步驟后，切成5 µm厚的切片，在水浴鍋中展開(kāi)后撈到多聚賴(lài)氨酸處理的載波片上。60°C 干燥箱中放60 min后放到37°C 烤箱中待用。梯度二甲苯和酒精脫蠟水化后用0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行抗原修復15 min，然后涼至室溫。3% H2O2 10 min阻斷內源性過(guò)氧化物酶活性。0.5% TritonX-100 打孔10 min。用兔抗鼠MTP1抗體(Alpha Diagnostic International, ADI, U.S.A)進(jìn)行FP1抗原的檢測（1:50稀釋?zhuān)豢褂?°C孵育過(guò)夜。陰性對照用PBS代替一抗。 二抗采用PV6001( PowerVisionTM Two-Step 組化試劑，北京中杉金橋生物技術(shù)公司) 以排除胎盤(pán)組織對于生物素的非特異性反應。顯色采用DAB，室溫3～15 min，鏡下控制顯色時(shí)間。蘇木素復染后脫水、透明、封片烤干并照相。
2.4 Western Blot
稱(chēng)取小塊胎盤(pán)組織（~300mg）于完全的RIPA裂解液中，用玻璃勻漿器勻漿，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑PMSF(1mmol/L)。然后于4°C 1,000×g 離心5 min。收集上清并轉入EP管4°C 12,000×g 離心10 min。再收集上清并分裝儲存于-80°C冰箱待用。總蛋白定量采用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce Endogen, Rockford, IL)。定量后計算50μg總蛋白的液體，用滅菌的去離子水補足體積至12 ml，并與3 ml 5×上樣緩沖液混合（4:1），混合物被煮沸5 min后涼至室溫。上樣量15 μl/孔，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1-2 h，轉膜3 h。 用0.1% PBST 配置的5%脫脂奶粉封閉1 h。 然后用兔抗鼠MTP1抗體一抗4°C孵育過(guò)夜(1:200稀釋)。β-actin (1:500，北京博奧森) 作為內參。二抗采用山羊抗兔二抗(Pierce Biotechnology, Inc. U.S.A) ，1:500稀釋?zhuān)覝胤跤? h。DAB顯色，用Gel-Pro Analyzer軟件進(jìn)行圖像掃描和分析。
2.5 實(shí)時(shí)定量PCR
2.5.1 RNA提取
胎盤(pán)組織總RNA的提取采用TRIzol試劑(Invitrogen Inc., Canada) ，按照說(shuō)明書(shū)步驟提取。50-100 mg的胎盤(pán)組織加入1ml TRIzol，用滅酶的玻璃勻漿器勻漿。每1 ml TRIzol加入0.2 ml氯仿，離心后取上層無(wú)色水樣層至另一EP管，然后按0.5 ml異丙醇/1 ml TRIzol比例加入異丙醇。離心后以75%乙醇
(1 ml/1 ml TRIzol)洗滌RNA沉淀。最后用DEPC水(20～40 μl )溶解沉淀。通過(guò)RNA定量( NanoDrop ND-1000) 計算A值( 260:280 nm)和濃度，1% 瓊脂糖電泳檢測提取的RNA的純度。
2.5.2 cDNA合成 反轉錄試劑盒采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit ( Fermentas)。在冰上給總RNA（500ng）中加入隨機引物，70°C變性5 min。然后加入5×反應緩沖液，RiboLockTM Ribonuclease 抑制劑以及10nmol/L dNTP Mix，混合物于25°C孵育5 min。最后加入RevertAid MMLV-反轉錄酶，25°C孵育10 min，然后42°C孵育60 min，最后于70°C孵育10 min終止反應。
2.5.3 實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)時(shí)定量PCR用SYBR Green I 熒光嵌合法，ABI Prism 7000 Sequence Detector (PE Applied Biosystems, Courtaboeuf, France)。引物序列如下：FP1: 5´-GAGCAGCAGCAGCGATAG-3´(上游)和5´-AGAATGACCAAGGTAGAGAAGG-3´(下游)；β-actin: 5´-GCGTAGCATTAAGGAGAAG-3´(上游)和 5´-GAAGGAAGGCTGGAAGAG-3´(下游)。
PCR總反應體積25 μl，每個(gè)樣品重復3次。PCR反應混合物包括12.5 μl 的SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Co. Ltd, Osaka, Japan)，1.0 μl上游和下游引物（10 umol/L），8.5 μl 的H2O 和2.0 μl 的cDNA。PCR循環(huán)：95°C變性60 s， 95°C (15s) 40個(gè)循環(huán)，55°C退火15s，然后72°C (45s)。PCR擴增實(shí)時(shí)記錄的溶解曲線(xiàn)分析和PCR擴增產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳用于辨別引物二聚體和非特異性擴增。
每個(gè)樣品的擴增的Ct值以β-actin的作為參照。Ct 值是指每個(gè)反應管內的熒光信號達到閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數。沒(méi)有干預的樣品作為參考樣品。相對定量采用相應的軟件( Relative Expression Software Tool – 384, Dr. Michael Pfaffl)進(jìn)行分析（計算方法基于2-△△Ct 值）。
2.6 統計分析
統計分析用SPSS軟件，全部數據表達以 ±s表示,三組對象（非貧血組、輕度貧血組、中度貧血組）之間比較用單因素方差分析，如果需要兩組之間比較則采用LSD檢驗。P<0.05認為有統計學(xué)顯著(zhù)性。
3 結果
3.1 母親的臨床特征
40名研究對象中18名沒(méi)有貧血，17名有輕度貧血，5名中度貧血。母親平均年齡為（29.2 ± 4.0）歲（23～39歲）。平均孕齡為(39.1 ± 1.5)周（37～42周）。 三組對象母親的年齡和孕齡沒(méi)有顯著(zhù)差別。
3.2 FP1蛋白在人足月胎盤(pán)的定位
FP1染色主要在STB細胞，且主要分布于胞漿，胎盤(pán)其它細胞幾乎不表達（圖1）。三組的染色定位一致，染色強度沒(méi)有明顯差異。
圖1 FP1蛋白在人足月胎盤(pán)的定位(´400)
(a) FP1蛋白的陽(yáng)性表達 (b) 陰性對照。M (母體面)； F (胎兒面)；→ (指向陽(yáng)性染色部位)。
Figure 1. The localization of FP1 protein expression in human term placenta (´400). (A) FP1 protein positive expression. (B) Negative control image showed no positive staining. M (maternal side); F (fetal side); → (point to positive staining)
3.3 不同母親鐵狀態(tài)下胎盤(pán)FP1蛋白表達
Western Blot 顯色，FP1蛋白條帶大約在~62 kDa位置；β-actin條帶約在~42kDa位置。雖然三組的FP1蛋白表達呈逐漸降低的趨勢，但沒(méi)有明顯的統計學(xué)差異。見(jiàn)圖2。
圖2 不同母親鐵狀態(tài)下胎盤(pán)FP1蛋白表達的變化
Figure 2. Change of FP1 protein expression in human term placenta with different maternal iron status
3.4 不同母親鐵狀態(tài)下胎盤(pán)FP1 mRNA表達
實(shí)時(shí)定量PCR擴增曲線(xiàn)平滑，溶解曲線(xiàn)呈單峰型。擴增產(chǎn)物電泳顯示單一條帶。說(shuō)明沒(méi)有引物二聚體和非特異性擴增。統計分析結果顯示，三組之間FP1的mRNA表達也沒(méi)有明顯的統計學(xué)差異。而且mRNA表達和蛋白表達并不一致。見(jiàn)圖3。
圖3 不同母親鐵狀態(tài)下胎盤(pán)FP1 mRNA表達的變化
Figure 3. Change of FP1 mRNA expression in human term placenta with different maternal iron status
4 討論
有關(guān)胎盤(pán)鐵輸出的分子機制，人們一直在探索。早認為可能是以低分子量鐵通過(guò)基膜進(jìn)入胎兒血液循環(huán)的[4]。后來(lái)發(fā)現STB的胎兒面和母體面均有TfR1的分布，而且二者都能結合并內化Tf[5]。因此對胎兒面TfR1可能參與鐵從胎盤(pán)到胎兒血液循環(huán)的跨基底膜轉運過(guò)程進(jìn)行了一些嘗試性的研究，但研究結果不能被合理地解釋[6]。直到2000年FP1的發(fā)現為人們進(jìn)一步研究該問(wèn)題提供了一個(gè)新的線(xiàn)索和希望。
研究表明，FP1在參與機體鐵穩態(tài)的組織有廣泛的表達，而且在這些組織里起了重要的鐵輸出作用[7]。比如在十二指腸，FP1定位于十二指腸上皮細胞的基側膜，負責十二指腸的鐵向體循環(huán)的輸出[8]。在肝臟和脾臟，FP1定位于網(wǎng)狀內皮系統細胞的胞漿，并且參與枯否細胞的鐵的再循環(huán)[9]。然而，在人和嚙齒動(dòng)物的肺部，FP1卻定位于呼吸道上皮細胞的頂膜[10]。至于FP1在胎盤(pán)的表達，Bradley和Bastin等研究顯示位于STB的基側膜[11, 12]。本次研究只發(fā)現STB細胞定位而沒(méi)有顯示明確的基側膜定位。可能是由于本次研究采用的是靈敏度較低的DAB顯色而非免疫熒光定位。另外，也可能是本研究的一抗是抗鼠而非抗人的。但研究至少表明FP1確實(shí)定位于STB細胞，至于亞細胞定位可以采用更加精確的方法進(jìn)一步證實(shí)。
研究表明，FP1表達的調節具有組織特異性。在十二指腸，FP1的表達受HEPC的調節。HEPC是機體鐵穩態(tài)的重要調節因子[13-17]， FP1是其發(fā)揮作用的重要下游因子。在肝臟和肺臟，FP1顯然受鐵反應元件（IRE）/ 鐵調節蛋白（IRPS）系統的調節[18]。而在PC12細胞，FP1的調節似乎又在轉錄水平而不受IRE/IRPs介導[19]。另外，研究還顯示FP1的表達還可能受發(fā)育的調節[2, 20, 21]。在胎盤(pán)，FP1表達隨孕齡的增加而增加，妊娠晚期（胎盤(pán)鐵轉運最大的時(shí)期）表達最高[3]。Martin[22]的研究顯示，HEPC轉基因胚胎的胎盤(pán)鐵轉運明顯降低，但胎盤(pán)FP1的mRNA表達并無(wú)明顯變化，提示胎盤(pán)FP1表達可能不受HEPC調節。Gambling[23]等研究發(fā)現，在母體貧血時(shí)胎盤(pán)FP1mRNA表達也無(wú)明顯變化。本研究也沒(méi)有發(fā)現母體不同鐵狀態(tài)下胎盤(pán)FP1的mRNA表達有明顯的差別，而且我們也沒(méi)有發(fā)現FP1蛋白表達的明顯差異。另外，Bradley [11] 等研究也顯示胎盤(pán)FP1蛋白的表達與IRPs活性無(wú)關(guān)。據此，我們推測胎盤(pán)FP1表達不受IRE/IRPs系統調節，至少它可能不是主要的調節方式。本研究結果顯示胎盤(pán)FP1蛋白表達變化的趨勢和mRNA變化的趨勢并不十分一致，也提示人類(lèi)胎盤(pán)FP1的表達可能有多種調節機制，如轉錄后和翻譯后的調節。雖然本次研究沒(méi)有同時(shí)測定母-胎鐵轉運量的變化，但既往的研究[23, 24]顯示，母親鐵缺乏時(shí)胎盤(pán)的鐵轉運能力是增強的，據此我們可以推測，除了FP1外，可能還有其它的因子直接或間接參與胎盤(pán)的鐵輸出。
（致謝：感謝西安交通大學(xué)醫學(xué)院的呂社民教授、鄭鵬生教授以及黃辰副教授給予的幫助和指導。）
參考文獻：
1. GANZ T, GEFFEN D. Cellular iron: Ferroportin is the only way out[J]. Cell metablism, 2005: 155-157.
2. MCKIE AT, MARCIANI P, ROLFS A, et al. A Novel Duodenal Iron -Regulated Transporter,IREG1,Implicated in the Basolateral Transfer of Iron to the Circulation[J]. Molecular Cell, 2000, 5: 299-309.
3. DONOVAN A, BROWNLLIE A, ZHOU Y, et al. Positional cloning of zebrafish ferroportin1 identifies a conserved vertebrate iron exporter[J]. Nature, 2000, 403: 776-781.
4. VAN DIJK JP, VAN KREEL BK, HEEREN JWA. Studies on the mechanisms involved in iron transfer across the isolated guinea pig placenta by means of bolus experiments [J]. J Dev Physiol, 1985, 7: 1-16.
5. VERRIJT CEH, KROOS MJ, HUIJSKES-HEINS MIE, et al. Accumulation and release of iron in polarly and non-polarly cultured trophoblast cells isolated from human term placentas[J]. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 1999, 86: 73–81.
6. VERRIJT CEH. VECTORIAL aspects of iron transfer in human term placenta[J]. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 1999, 83: 125-126.
7. ABBOUD S, HAILE DJ. A Novel Mammalian Iron-regulated Protein Involved in Intracellular Iron Metabolism[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2000, 275: 19906-19912.
8. ZOLLER H, THEURL I, KOCK R, et al. Mechanisms of Iron Mediated Regulation of the Duodenal Iron Transporters Divalent Metal Transporter 1 and Ferroportin 1[J]. Blood Cells, Molecules, and Diseases, 2002, 29: 488-497.
9. GALLI´A, BERGAMASCHI G, RECALDE H, et al. Ferroportin gene silencing induces iron retention and enhances ferritin synthesis in human macrophages[J]. British Journal of Haematology, 2004, 127: 598-603.
10. YANG F, HAILE DJ, WANG X, et al. Apical location of ferroportin 1 in airway epithelia and its role in iron detoxification in the lung[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2005, 289: L14-L23.
11. BRADLEY J, LEIBOLD EA, HARRIS ZL,et al. Influence of gestational age and fetal iron status on IRP activity and iron transporter protein expression in third-trimester human placenta[J]. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol, 2004, 287: 894-901.
12. BASTIN J, DRAKESMITH H, REES M, et al. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver[J]. British Journal of Haematology, 2006, 134: 532-543.
13. NEMETH E, TUTTLE MS, POWELSON J, et al. Hepcidin Regulates Cellular Iron Efflux by Binding to Ferroportin and Inducing Its Internalization[J]. Science, 2004, 306: 2090-2093.
14. ATANASIU V, MANOLESCU B, STOIAN I. Hepcidin – central regulator of iron metabolism[J]. European Journal of Haematology, 2006, 78: 1-10.
15. DEICHER R, HORL WH. New insights into the regulation of iron homeostasis[J]. European Journal of Clinical Investigation, 2006, 36: 301-309.
16. KOSS L. Hepcidin Decreases Ferroportin 1 Expression in a Mouse Macrophage Cell Line[J]. Journal of Undergraduate Research, 2005, 6.
17. YAMAJI S, SHARP P, RAMESH B, et al. Inhibition of iron transport across human intestinal epithelial cells by hepcidin[J]. Blood, 2004, 104: 2178-2180.
18. LYMBOUSSAKI A, PIGNATTI E, MONTOSI G, et al. The role of the iron responsive element in the control of ferroportin1/IREG1/MTP1 gene expression[J]. Journal of Hepatology, 2003, 39: 710-715.
19. CHEN Y, QIAN ZM, DU J, et al. Iron loading inhibits ferroportin1 expression in PC12 cells[J]. Neurochemistry International, 2005, 47: 507-513.
20. LEONG WI, LONNERDAL B. Iron transporters in rat mammary gland: effects of different stages of lactation and maternal iron status[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2005, 81: 445-453.
21. [21]. LEONG WI, BOWLUS CL, TALLKVIST J, et al. DMT1 and FPN1 expression during infancy: developmental regulation of iron absorption[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2003, 285: 1153-1161.
22. MARTIN ME, NICOLAS G, HETET G, et al. Transferrin receptor 1 mRNA is downregulated in placenta of hepcidin transgenic embryos[J]. FEBS Letters 2004, 574: 187-191.
23. GAMBLING L, DANZEISEN R, GAIR S, et al. Effect of iron deficiency on placental transfer of iron and expression of iron transport proteins in vivo and in vitro[J]. Biochem. J, 2001, 356: 883-889.
24. O’BRIEN KO, ZAVALETA N, ABRAMS SA, et al. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy[J]. Am J Clin Nutr, 2003, 77: 924-930.
收稿日期
中國常用益生菌菌種的耐藥性研究
徐進(jìn) 劉秀梅 楊寶蘭 李志剛 姚景會(huì ) 余冬敏
中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所，北京 10021
摘要：采用肉湯稀釋法，對中國益生菌保健品行業(yè)常用的9株雙歧桿菌和22株乳桿菌，共計31株益生菌進(jìn)行了20種抗生素的耐藥性檢測。結果表明： 31株益生菌均對下列抗生素敏感：氨芐西林、青霉素、亞胺培南、慶大霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、加替沙星、紅霉、素克林霉素、四環(huán)素、利福平和頭孢噻肟；而對萘啶酮酸、萬(wàn)古霉素和磷霉素的耐藥率較高。
關(guān)鍵詞：益生菌 耐藥性
Antimicrobial Susceptibility of Probiotics
Xu Jin, Liu Xiumei, Yao Baolan, Li Zhigang, Yao jinghui, Yu Dongmin
National Institute of Nutrition and Food Safety, China Center for Control and Prevention, Beijing 100021, China
Abstract: The aim of our study was to analyse the antibiotic susceptibility of 31 probiotics strains, including 9 Bifidobacterium and 22 Lactobacillus used for the manufacture of various fermented foods in China. Probiotics are tested for minimum inhibitory concentrations(MIC) of 20 kinds of antibiotics by broth dilution method on cation-adjusted Mueller-Hinton broth with lysed horse blood. 31 strains of probiotics were sensitive to ampicillin ,penicillin ,imipenem ,gentamicine, amoxicillin, amoxicillin/clavulanic acid ,gatifloxacin , erythromycin , clindamycin, and resistant to nalidixic acid, vancomycine , fosfomycin.
Key words: Probiotics, Antibiotic Susceptibility Testing
2002年FAO／WHO(Food and Agriculture Organization/World Health Organization)聯(lián)合專(zhuān)家組提出了《用于食品的益生菌安全性評價(jià)指導原則》，原則指出益生菌是指活的微生物，當人體攝入足夠量的時(shí)候可對人體產(chǎn)生有益的作用。通常所說(shuō)的益生菌主要就是指乳桿菌和雙歧桿菌等乳酸菌，這些益生菌廣泛應用于發(fā)酵食品中，如酸奶、乳酪，或者將益生菌直接制成菌粉食用。
傳統的益生菌菌種，比如嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在安全應用上已有很長(cháng)的歷史，被認為是沒(méi)有致病可能性的共生微生物體。但目前新的益生菌菌種不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)進(jìn)入市場(chǎng)，這些新菌種能否分享傳統菌種的安全性，目前引起國外專(zhuān)家的極大爭論。鑒于此，FAO／WHO在《用于食品的益生菌安全性評價(jià)指導原則》中指出益生菌存在的可能危害包括：①益生菌進(jìn)入血液引起的人體全身性感染（菌血癥和感染性心內膜炎）；②益生菌產(chǎn)生有害的代謝活性產(chǎn)物對人體產(chǎn)生的不良反應；③食用益生菌制劑后對敏感個(gè)體的免疫刺激作用；④益生菌菌種在長(cháng)期使用后所攜帶耐藥基因的轉移。由益生菌引起的菌血癥，產(chǎn)生的有害代謝活性產(chǎn)物和個(gè)體免疫刺激作用發(fā)生率非常低，而某些益生菌對抗生素具有天然的耐藥性，所以目前益生菌的安全性問(wèn)題主要集中在由益生菌所攜帶耐藥基因轉移引起的耐藥性問(wèn)題，益生菌菌株的耐藥性評價(jià)時(shí)目前國際上益生菌安全評價(jià)的首要內容。本文采用肉湯稀釋法，對2005~2006年在中國保健品市場(chǎng)常用的22株乳桿菌和9株雙歧桿菌的耐藥性進(jìn)行了分析，初步評估中國目前所使用的益生菌的耐藥狀況，為中國益生菌的安全性評估提供技術(shù)依據。
1 材料與方法：
1.1材料：益生菌為中國保健食品行業(yè)常用菌種，包括9株雙歧桿菌（Bifidobacterium）和22株乳桿菌（Lactobacillus）。
1.2益生菌菌種藥物敏感性試驗
采用美國Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)推薦的96微孔肉湯稀釋法，培養基為金屬離子調整的MH培養基（Mueller-Hinton Agar）加裂解的馬血（2.5~5% v/v）[1]。96微孔耐藥板及抗生素濃度的制備由天津金章公司提供。質(zhì)控菌株為CLSI推薦的Streptococcus pneumoniae ATCC49619。使用的抗生素（OXOID，英國）種類(lèi)及濃度范圍見(jiàn)表1。
表1 本實(shí)驗使用的抗生素及其濃度范圍
Table 1 Antibiotics used in this study
|
序號 |
抗生素名稱(chēng) |
中文 |
濃度(μg/ml) |
|
1 |
Ampicillin |
氨芐西林 |
0.016-256 |
|
2 |
Penicillin |
青霉素 |
0.016-256 |
|
3 |
Imipenem |
亞胺培南 |
0.016-256 |
|
4 |
Gentamicine |
慶大霉素 |
0.016-256 |
|
5 |
Vancomycine |
萬(wàn)古霉素 |
0.016-256 |
|
6 |
Erythromycin |
紅霉素 |
0.016-256 |
|
7 |
Clindamycin |
克林霉素 |
0.016-256 |
|
8 |
Trimethoprin/sulfamethoxazone |
甲氧芐胺嘧啶/磺胺甲基異噁唑 |
0.002-32 |
|
9 |
Amoxicillin |
阿莫西林 |
0.016-256 |
|
10 |
Amoxicillin/clavulanic acid |
阿莫西林/棒酸 |
0.016-256 |
|
11 |
Gatifloxacin |
加替沙星 |
0.016-256 |
|
12 |
Ciprofloxacin |
環(huán)丙沙星 |
0.002-32 |
|
13 |
Chloramphenicol |
氯霉素 |
0.016-256 |
|
14 |
Streptomyxine |
鏈霉素 |
0.016-256 |
|
15 |
Tetracycline |
四環(huán)素 |
0.016-256 |
|
16 |
Fosfomycin |
磷霉素 |
0.016-256 |
|
17 |
Kanamycine |
卡那霉素 |
0.016-256 |
|
18 |
Nalidixic acid |
萘啶酮酸 |
0.016-256 |
|
19 |
Ceftriaxone |
頭孢曲松 |
0.016-256 |
|
20 |
Cephalothin |
頭孢噻吩 |
0.016-256 |
|
21 |
Cefepime |
頭孢吡肟 |
0.016-256 |
|
22 |
Norfloxacine |
諾氟沙星 |
0.016-256 |
|
23 |
Rifampin |
利福平 |
0.016-256 |
|
24 |
Cefotaxime |
頭孢噻肟 |
0.016-256 |
2、藥物敏感性試驗結果:
本試驗益生菌菌種對不同抗生素的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentrations , MIC）范圍見(jiàn)表2。
表2 益生菌菌種對不同抗生素的最低抑菌濃度（MIC）范圍(μg/ml)
Table 2 Minimum inhibitory concentrations of Probiotics to different antibiotics
|
抗生素 |
耐藥判定標準的MIC值 |
乳桿菌（22株） |
|
雙歧桿菌 （9株） | ||
|
MIC范圍 |
敏感率（%） |
|
MIC范圍 |
敏感率（%） | ||
|
氨芐西林 |
≥8 （3） |
0.016-1 |
100.00 |
|
0.016-4 |
100.00 |
|
青霉素 |
≥8 （3） |
0.016-4 |
100.00 |
|
0.016-4 |
100.00 |
|
亞胺培南 |
≥0.5 （3） |
0.016-0.25 |
100.00 |
|
0.016-0.25 |
100.00 |
|
慶大霉素 |
≥16 （3） |
0.016-2 |
100.00 |
|
0.016-4 |
100.00 |
|
阿莫西林 |
≥8（2） |
0.016-4 |
100.00 |
|
0.016-4 |
100.00 |
|
阿莫西林/棒酸 |
≥8 （2） |
0.016-4 |
100.00 |
|
0.016-0.5 |
100.00 |
|
加替沙星 |
≥4 （2） |
0.016-1 |
100.00 |
|
0.016-4 |
100.00 |
|
紅霉素 |
≥8（3） |
0.016-0.25 |
100.00 |
|
0.5-0.016 |
100.00 |
|
克林霉素 |
≥8 （2） |
0.016-0.5 |
100.00 |
|
0.016-4 |
100.00 |
|
四環(huán)素 |
≥8 （2） |
0.016-4 |
100.00 |
|
0.016-16 |
100.00 |
|
利福平 |
≥4 （2） |
0.016-2 |
100.00 |
|
0.016-2 |
100.00 |
|
頭孢噻肟 |
≥32 （2） |
0.016-8 |
100.00 |
|
0.125-4 |
100.00 |
|
鏈霉素 |
≥16 （2） |
0.016-16 |
95.45 |
|
0.016-8 |
100.00 |
|
頭孢噻吩 |
≥32 （1） |
0.125-64 |
90.91 |
|
0.125-64 |
77.78 |
|
氯霉素 |
≥4 （2） |
0.012-4 |
90.91 |
|
0.016-4 |
100.00 |
|
環(huán)丙沙星 |
≥4（1） |
0.016-8 |
81.82 |
|
0.016-16 |
100.00 |
|
諾氟沙星 |
≥16 （2） |
0.125-128 |
77.27 |
|
2-64 |
66.67 |
|
甲氧芐胺嘧啶/磺胺甲基異噁唑 |
≥4 （2） |
0.016-32 |
72.27 |
|
0.016-32 |
66.67 |
|
卡那霉素 |
≥16 （2） |
0.5-64 |
68.18 |
|
0.0312-64 |
88.89 |
|
頭孢曲松 |
≥32 （1） |
0.0625-32 |
63.64 |
|
0.0312-16 |
100.00 |
|
頭孢吡肟 |
≥32 （1） |
0.0312-128 |
54.55 |
|
0.016-32 |
100.00 |
|
磷霉素 |
≥32 （1） |
0.125-256 |
31.82 |
|
0.016-256 |
66.67 |
|
萬(wàn)古霉素 |
≥32 （3） |
0.25-256 |
27.27 |
|
0.016-256 |
66.67 |
|
萘啶酮酸 |
≥32（1） |
128-256 |
0.00 |
|
1-256 |
33.33 |
注：（1）Scientific committee on animal nutrition (SCAN) [9]；
（2）本試驗判定標準[2,3]；
（3）CLSI[1] ；
由表2可見(jiàn)，22株乳桿菌和9株雙歧桿菌有相似的耐藥譜，乳桿菌對本實(shí)驗所選用的抗生素的耐藥性要高于雙歧桿菌。22株乳桿菌和9株雙歧桿菌均對下列抗生素敏感：氨芐西林、青霉素、亞胺培南、慶大霉素、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、加替沙星、紅霉、素克林霉素、四環(huán)素、利福平和頭孢噻肟。22株乳桿菌對萘啶酮酸、萬(wàn)古霉素和磷霉素的耐藥性較高，分別為100%，72.63%和68.18%。
3、討論
益生菌安全性一個(gè)非常重要的方面是其耐藥性。本研究結果顯示，22株乳桿菌和9株雙歧桿菌有相似的耐藥譜。在2005年檢測的中國常用發(fā)酵乳制品的12株益生菌中，耐藥的主要模式為丁胺卡那霉素-卡那霉素-萘啶酮酸-復方新諾明-甲氧芐胺嘧啶-萬(wàn)古霉素[4]，和本次實(shí)驗的結果相似。從國內外資料來(lái)看，益生菌均耐受多種抗生素。Katla 等對挪威市場(chǎng)的189株乳酸菌的耐藥檢測結果表明[5]：189株乳酸菌均對下列抗生素敏感：氨芐西林、青霉素G、頭孢噻吩、萬(wàn)古霉素、桿菌肽、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星。Temmerman等對歐洲益生菌產(chǎn)品市場(chǎng)分離到的187株益生菌的耐藥檢測表明[6]：對卡那霉素，萬(wàn)古霉素、四環(huán)素、青霉素G、紅霉素和氯霉素的耐藥率分別為79%、65%、26%、23%、16%和11%，68.4%的菌株具有多重耐藥特性。Lim等對韓國市場(chǎng)37株雙歧桿菌的耐藥檢測結果表明[7]：大部分雙歧桿菌耐受頭孢噻吩、卡那霉素、新霉素、萘啶酮酸和多黏菌素B，部分雙歧桿菌耐受慶大霉素和鏈霉素。Masco等對比利時(shí)市場(chǎng)100株乳酸菌的耐藥檢測結果表明[8]：所有菌株均對阿莫西林、氯霉素、紅霉素和萬(wàn)古霉素敏感；其中11株雙歧桿菌均耐受慶大霉素和多年菌素B。綜合國內與國際資料來(lái)看，無(wú)論是乳桿菌還是雙歧桿菌，萘啶酮酸和卡那霉素的耐藥率較高，其他抗生素的結果則有很大差異，不同的益生菌菌種顯示了各自復雜的耐藥特性。這主要是因為，2007年CLSI才出版了乳酸菌耐藥試驗的標準[1]，在此之前由于各實(shí)驗室所采用的培養基，使用的抗生素，檢測的方法和質(zhì)控菌株不同，使得不同試驗室間的數據也不同。本研究所采用的方法為2007年CLSI出版的乳酸菌耐藥試驗的標準。
對益生菌耐藥性的管理上不同國家及國際組織也不盡相同。美國FDA對益生菌的耐藥性沒(méi)有特別規定，把益生菌類(lèi)發(fā)酵食品作為GRAS (generally recognized as safe)級來(lái)看待，需要明確的是美國FDA并不是將益生菌菌株本身做為GRAS 來(lái)看待，而是指益生菌發(fā)酵的食品。益生菌及其制品在歐洲使用歷史悠久并銷(xiāo)量巨大，因此歐盟食品安全局提出了Qualified Perception of Safety(QPS)概念[9]。其內涵是既不等同于有長(cháng)期使用歷史的益生菌就是安全的觀(guān)點(diǎn)，也不能將益生菌的安全性評價(jià)規定的過(guò)于嚴格而阻礙益生菌的市場(chǎng)發(fā)展，就益生菌的耐藥性而言，規定益生菌不得攜帶可轉移的耐藥基因。中國的益生菌評審機構目前尚未對益生菌耐藥性作出明確的規定。從歐盟食品安全局對益生菌安全性的管理來(lái)看，如何評價(jià)益生菌的耐藥特性對人群健康的影響將是對益生菌進(jìn)行危險性評估最重要的內容之一。
5 參考文獻
1. JAMES H，Janet HINDER， et al. Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or Fastidious Bacreria[M] .Clinical and laboratory standards institute..2007,26(19):24-25.
2. ANJA S. Hummel, Christian Hertel, et al. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of Lactic acid bacteria[J]. Applied and Environment Microbiology, 2007, 73(3):730-739.
3. MOUBARECK C, GAVINI F, et al. Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005(1)38-44.
4. 徐進(jìn),劉秀梅. 國內保健食品常用益生菌株的耐藥性分析[J]. 中國食品衛生雜志, 2005,17（2）:108-112.
5. KATLA AK, KRUSE H, et al. Antimicrobial susceptibility of starter culture bacteria used in Norwegian dairy products[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001;67(1-2):147-52.
6. TEMMERMAN R, SWINGS J, et al. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products[J]. International Journal of FoodMicrobiology, 2003; 81(1):1-10.
7. LIM K S , HUH S C, et al. Antimicrobial Susceptibility of Bifidobacteria[J]. Journal Dairy Science, 1993,76:2168-2174.
8. MASCO L, HOORDe K Van, et al. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products [J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005:185-94.
9. European food safety authority. Scientific committee on animal nutrition on the criteria for assessing the micro-organisms resistant to antibiotics of human clinical and veterinary importance. revised on 24 January 2003.
調查研究
中國5歲以下兒童營(yíng)養不良現狀及其變化趨勢的研究
劉愛(ài)東 趙麗云 于冬梅 于文濤 賈鳳梅 張繼國 翟鳳英
中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所，北京 100050
摘要：目的 分析我國5歲以下兒童的營(yíng)養不良狀況及變化趨勢，為制定兒童營(yíng)養政策提供依據。方法 采用多階段分層整群隨機抽樣的方法，按照東、中、西三類(lèi)地區和城市、農村的分層原則，在全國選取17607名5歲以下兒童，測量?jì)和纳砀撸ㄩL(cháng)）和體重。結果 2006年中國5歲以下兒童生長(cháng)遲緩率為9.9%，低體重率為5.9%，消瘦率為2.2%；兒童生長(cháng)遲緩率農村是城市的5.3倍，低體重率農村是城市的4.6倍，差異顯著(zhù)（P<0.05）；中、西部地區兒童營(yíng)養不良率顯著(zhù)高于東部地區（P<0.05）；與2002年相比，2006年兒童生長(cháng)遲緩率下降了30.8%，兒童低體重率下降了24.4%。結論 近幾年來(lái)，中國5歲以下兒童營(yíng)養不良率逐年下降，下降速度城市高于農村。西部地區農村兒童營(yíng)養不良問(wèn)題仍有待改善，同時(shí)中部地區農村兒童的營(yíng)養不良狀況也應得到充分關(guān)注。
關(guān)鍵詞 5歲以下兒童 營(yíng)養不良 變化趨勢
Study on malnutrition status and changing trend of Chinese children less than 5 years
Liu Ai-dong, Zhao Li-yun, Yu Dong-mei, Yu Wen-tao, Jia Feng-mei, Zhang ji-guo,Zhai Feng-ying
National Institute for Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Bejing 100050, China
Abstract: Objective To analysis the malnutrition status and changing trend of the children less than five years in China, and to afford the reference information for the establishment of children nutrition related policies. Methods According to the classification of east, middle and west areas in China, as well as urban and rural, the multi-stage cluster probability sampling was used to select randomly total 17607 children under 5 years, whose weight and height were measured in standard method. Outcome The stunting prevalence of Chinese children under 5 years is 9.9%, the underweight prevalence is 5.9% and the wasting prevalence is 2.2%. There is significant difference of the malnutrition prevalence between the urban areas and rural areas (p<0.05). The prevalence of stunting of rural children is 5.3 times higher than that of urban as well as the prevalence of underweight in rural is 4.6 times higher
基金項目：衛生部婦社司“婦女和兒童發(fā)展綱要指標調查”項目
作者簡(jiǎn)介：劉愛(ài)東，男，碩士，助理研究員
than that in urban. In the same way, the prevalence of malnutrition in middle and west areas is significantly higher than the prevalence in east area (p<0.05). Compared with the data of Chinese Nutrition and Health Survey (CNHS) in 2002, the prevalence of children stunting and underweight decreased by 30.8% and 24.4% respectively in 2006. Conclusion In recent years, the malnutrition prevalence of Chinese children under 5 years declined yearly and the prevalence of malnutrition in urban decreased faster than that in rural. The nutrition status of the children in west areas needs more improvement and at the same time, the status of children nutrition of west area also requires more concerns.
Key word: children under 5 years malnutrition changing trend
<5歲兒童營(yíng)養不良會(huì )對其一生的健康產(chǎn)生不良影響，不僅會(huì )造成兒童當前身體和智力的發(fā)育遲緩，同時(shí)還會(huì )增加成年時(shí)期患肥胖、高血壓、糖尿病等慢性疾病的危險。本文利用2006年衛生部在全國范圍開(kāi)展的“中國兒童發(fā)展綱要（2001－2010）”和“中國婦女發(fā)展綱要（2001－2010）”（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“兩綱”）評估指標調查數據，對中國<5歲兒童營(yíng)養不良狀況及近年來(lái)變化趨勢進(jìn)行分析，及時(shí)了解5歲以下兒童的營(yíng)養不良狀況及變化趨勢，為國家制定下一步相應的政策提供依據。
1 研究對象和方法
1.1對象 利用國家發(fā)改委提出的將全國31個(gè)省、自治區、直轄市分成東、中、西地區的方法，同時(shí)將各類(lèi)地區分為城市和農村兩層，采用多階段隨機整群抽樣方法，在全國14個(gè)省、自治區和直轄市中隨機抽取43個(gè)市、縣作為調查點(diǎn)，在每個(gè)市、縣中再按照分層隨機方法分別抽取370個(gè)和350個(gè)5歲以下兒童，各年齡組人數保持均衡。
1.2 研究方法 兒童的營(yíng)養狀況評價(jià)采用Z評分法，以1978年WHO/NCHS推薦的性別年齡別身高體重參考值作為評價(jià)兒童營(yíng)養不良的評價(jià)標準。低于標準年齡別身高、年齡別體重、身高別體重2個(gè)標準差為中、重度營(yíng)養不良。根據2002年中國居民營(yíng)養與健康調查（CNHS2002）以及2005年全國營(yíng)養監測系統（CFNSS2005）數據結果比較分析變化趨勢。采用SAS8.2統計軟件進(jìn)行統計。
2 結果
2.1基本情況
本研究共調查了5歲以下兒童17607人，各年齡組兒童人數比例基本均衡。城市兒童6541人(占37.2%)，農村兒童11066人(占62.8%)；男孩9478人（占53.8％），女孩8129人（占46.2％）；按三大經(jīng)濟地帶劃分，東部地區共調查5241人、中部地區4725人，西部地區7641人，各占29.8%、26.8%和43.4%。
2.2 全國5歲以下兒童中、重度營(yíng)養不良率
2006年中國5歲以下兒童生長(cháng)遲緩率為9.9％，低體重率為5.9％，消瘦率為2.2%。低體重率男孩為6.1%，女孩為5.8%；生長(cháng)遲緩率男孩為10.5%，女孩為9.4%，營(yíng)養不良率無(wú)性別差異（P>0.05）。
2.2.1 城鄉之間差異 全國城市和農村5歲以下兒童營(yíng)養不良率存在顯著(zhù)性差異（P<0.01）。兒童生長(cháng)遲緩率農村（11.7%）是城市（2.2%）的5.3倍，兒童低體重率農村（6.9%）為城市（1.5%）的4.6倍。其中西部農村地區兒童生長(cháng)遲緩率和低體重率最高，分別達15.5%和8.6％。
2.2.2 地區之間差異 從東、中、西三大地區來(lái)看，5歲以下兒童營(yíng)養不良率差異顯著(zhù)（P<0.05）(見(jiàn)表1、表2)。東部地區最低，生長(cháng)遲緩率4.9％、低體重率3.5％；西部地區最高，生長(cháng)遲緩率和低體重率分別為13.9％和7.8％；中部地區兒童營(yíng)養不良狀況更接近于西部地區，生長(cháng)遲緩率和低體重率分別為11.8%和7.0%。城鄉差異在三類(lèi)地區中也同樣存在，但西部地區的城鄉差距最大，而東部地區城鄉之間差距最小。
2.2.3 月齡之間差異 由表1、表2可見(jiàn)，全國1歲以?xún)葖雰荷L(cháng)遲緩率最低為6.1%，12~23個(gè)月齡時(shí)，開(kāi)始上升至12.9%，隨后稍有下降后又開(kāi)始上升，至48~59個(gè)月齡時(shí)達到最高13.1%；低體重率的變化趨勢和生長(cháng)遲緩率相似，1歲以?xún)取?2～23月齡，48～59月齡分別為2.4%、7.3%和7.4%。
表1 全國5歲以下兒童生長(cháng)遲緩率
Table 1 The stunting prevalence of Chinese children under five years (%)
|
月齡 |
東部地區 |
|
中部地區 |
|
西部地區 |
|
全國 | ||||||||
|
城市 |
農村 |
合計 |
城市 |
農村 |
合計 |
城市 |
農村 |
合計 |
城市 |
農村 |
合計 | ||||
|
0～ |
2.3 |
1.8 |
1.9 |
|
1.4 |
8.9 |
7.6 |
|
2.0 |
10.0 |
9.0 |
|
2.0 |
7.1 |
6.1 |
|
12～ |
2.3 |
7.5 |
6.1 |
|
1.8 |
16.6 |
15.0 |
|
3.1 |
20.2 |
18.1 |
|
2.3 |
15.0 |
12.9 |
|
24～ |
2.0 |
4.0 |
3.5 |
|
4.3 |
10.3 |
9.9 |
|
1.7 |
12.2 |
10.9 |
|
2.6 |
9.0 |
7.9 |
|
36～ |
0.2 |
6.8 |
5.1 |
|
2.9 |
12.8 |
11.8 |
|
2.4 |
15.7 |
14.1 |
|
1.5 |
12.0 |
10.2 |
|
48～ |
1.4 |
9.9 |
7.7 |
|
4.0 |
16.3 |
15.2 |
|
3.2 |
19.1 |
17.1 |
|
2.6 |
15.3 |
13.1 |
|
小計 |
1.6 |
6.0 |
4.9 |
|
2.9 |
12.9 |
11.8 |
|
2.5 |
15.5 |
13.9 |
|
2.2 |
| |