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青年科學(xué)工作者論壇2008年第2期
《衛生研究》--2008年第二期 牛源乳鐵蛋白體外抗HBsAg分泌的研究
論著(zhù)
牛源乳鐵蛋白體外抗HBsAg分泌的研究
李松濤 黃桂榮1 周海波 劉寧1*
東北農業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室 黑龍江 哈爾濱，150030
【摘要】 目的 探討牛源乳鐵蛋白(BLF)體外抑制乙型肝炎表面抗原分泌作用，為乳鐵蛋白應用于臨床治療乙型肝炎病毒(HBV)感染提供理論和實(shí)驗依據。 方法 以天然HBV感染HepG2細胞為模型，應用ELISA法測定細胞上清中的HBsAg水平，并用MTT法對BLF對HepG2細胞的毒性進(jìn)行研究。 結果 BLF對細胞的最大無(wú)毒劑量(TD0)為3.0 g/L，半數中毒劑量(TD50)為11.08 g/L；先用HBV對HepG2細胞進(jìn)行感染，再加入BLF，各濃度組BLF均對HBsAg分泌有一定抑制作用，BLF濃度 3.0 g/L時(shí)對HBsAg的抑制率達58.34%；將BLF與HBV陽(yáng)性血清作用后再接種于細胞，各實(shí)驗組均不能抑制HBsAg分泌，將BLF先與細胞作用后洗去BLF，在接種病毒后，BLF濃度0.5 g/L以上各組均能顯著(zhù)抑制HBsAg分泌，但BLF0.1 g/L組不能抑制HBsAg分泌。乳鐵蛋白水解物不能抑制HBsAg分泌。 結論 牛源乳鐵蛋白不能通過(guò)與HBV結合來(lái)阻斷對HepG2細胞的感染，但可以通過(guò)對HepG2細胞的保護來(lái)阻斷感染；當HepG2細胞感染HBV后，牛源乳鐵蛋白仍可抑制HBsAg分泌，將乳鐵蛋白水解后無(wú)抑制作用，說(shuō)明是乳鐵蛋特有結構起作用，但其機理有待深入研究。
【關(guān)鍵詞】 牛源乳鐵蛋白；體外；乙型肝炎表面抗原；HepG2細胞系；乳鐵蛋白水解物
Study of inhibition effect on hepatitis B surface antigen of bovine lactoferrin in vitro
LI Song-tao, HUANG Gui-rong1, ZHOU Hai-bo , LIU Ning
(1 *Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education; College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang, 150030. 2 Staff Room of Epidemiology, Harbin Medical University, Harbin Heilongjiang, 150086)
Corresponding author: LIU Ning (Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, North East Agriculture University, Harbin, Heilongjiang, 150030)
【Abstract】 Objective To probe inhibition effect on hepatitis B surface antigen (HBsAg) of bovine lactoferrin (BLF) in vitro, so as to provide theoretical as well as experimental basis for the clinical management of HBV infection. Methods Nature hepatitis B virus (HBV) was used to infect HepG2 cell as model, HBsAg in the culture supernatant was measured by ELISA, and MTT test was used to examine cytotoxic effect of BLF. Results The maximum nontoxic dose(TD0) in HepG2 cell of BLF is 3.0 g/L, 50% toxic dose(TD50) is 11.08 g/L; After HepG2 cell were infected with HBV, every BLF test group had effect on inhibiting HBsAg to some extent. At the highest concentration(3.0 g/L) BLF was most effective, exhibiting 58.34% inhibition; Mixing BLF with HBV, then HepG2 cell were infected with them, every BLF test concentrations were not shown to inhibit HBsAg; Adding BLF to HepG2 cell, then HepG2 cell were infected with HBV after washing BLF, test groups had significant effect on inhibiting HBsAg as concentration over 0.5 g/L, but BLF concentration 0.1 g/L did not inhibit HBsAg. HBsAg wasn’t inhibited by lactoferrin hydrolysate. Conclusion BLF was shown to inhibit HBV infection into HepG2 cell by protecting corresponding cell sites rather than binding to HBV; After HepG2 cell was infected, HBsAg also could be inhibited by BLF, lactoferrin hydrolysate didn’t have this function, so it was BLF structure’s work, but the deep mechanism need to be lucubrated.
【Key words】 Bovine lactoferrin, In vitro, hepatitis B surface antigen, HepG2 cell line，Lactoferrin hydrolysate
乙型肝炎是一個(gè)嚴重的公共衛生問(wèn)題。目前，全球有20億人已經(jīng)感染乙肝病毒，其中3.5億人為慢性乙肝病毒感染。15%～20%的慢性感染者將死于乙肝及其相關(guān)疾病。乙肝病毒是一種包含3200個(gè)堿基對外層被脂蛋白包被的雙鏈DNA病毒。乳鐵蛋白是一種能由多種粘膜分泌的鐵結合糖蛋白。研究表明，乳鐵蛋白可以抗多種DNA及RNA病毒，包括人體免疫缺陷性病毒、呼吸道合胞病毒、丙型肝炎病毒、輪狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、皰疹病毒、細胞巨化病毒、漢坦病毒。本研究以天然HBV轉染HepG2細胞為模型，對乳鐵蛋白早期抑制HBsAg分泌進(jìn)行研究。
1 材料和方法
1.1 材料
牛源乳鐵蛋白購自新西蘭乳品總公司(純度＞90%)；乙型肝炎病毒陽(yáng)性血清(5×108拷貝數/ml, HCV、HAV均陰性)由哈爾濱醫科大學(xué)第一附屬醫院提供；HepG2細胞系由哈爾濱醫科大學(xué)公共衛生學(xué)院流行病學(xué)教研室提供；DMEM培養基購自Intitrogen公司；胎牛血清(FBS)購自中國醫學(xué)科學(xué)院生物工程研究所；乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒購自上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（1:250）購自Amresco公司；胃蛋白酶（1:10 000）購自Sigma公司；酶標儀（美國伯樂(lè )公司）；洗板機（美國伯樂(lè )公司）。
1.2 方法
1.2.1 HepG2細胞的培養
將HepG2細胞接入25 cm2培養瓶中，每瓶加入DMEM培養液(含10%FBS)5 ml，置37℃，5%CO2恒溫培養箱中，次日更換含5%FBS的DMEM維持液，3～4天后傳代。
1.2.2 HBV病毒轉染HepG2細胞模型建立
HepG2細胞消化后以5′104個(gè)/ml接種于96孔培養板中，每孔0.2 ml，待細胞長(cháng)成單層后除去培養液，將HBV陽(yáng)性血清用DMEM培養基以10倍倍比進(jìn)行稀釋成6組濃度后以每孔0.2 ml加入培養板中，每個(gè)濃度設4個(gè)復孔并設陰性對照組，陰性對照組為健康人血清，于37℃孵育2h后扣除血清，更換維持液進(jìn)行培養，應用乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒分別于48、96、144 h測定細胞上清的HBsAg的A值，并計算P/N值。其中每48 h更換培養液一次，更換前用PBS清洗3遍以除去細胞表面HBsAg殘留。
P/N=樣品平均A值/陰性對照平均A值(當P/N＞2.1時(shí)HBsAg為陽(yáng)性)
1.2.3 乳鐵蛋白水解物的制備
根據國外文獻[1]我們取10gBLF溶于500ml滅菌超純水，水浴加熱至37℃后用HCl調節pH值至2.5，加胃蛋白酶300mg，胰蛋白酶300mg于37℃水浴作用1h后轉至80℃水浴15min終止酶解，10000′ g離心5min，取上清凍干備用。
1.2.4細胞毒性試驗
HepG2細胞以5′104個(gè)/ml接種于96孔培養板中，每孔0.2ml，待細胞長(cháng)成單層后除去培養液，加入BLF濃度分別為24、12、6.0、3.0、1.5 g/L，干擾素a濃度分別為100、500、2 500 u/ml和乳鐵蛋白水解物濃度分別為6.0、3.0、1.5 g/L的培養液進(jìn)行培養，每個(gè)濃度設4個(gè)復孔并設空白對照組及正常細胞對照組，空白對照只加培養基，不加細胞，每?jì)商鞊Q同濃度藥一次，96小時(shí)后，應用MTT法測定細胞存活率以及半數中毒劑量(TD50)。
細胞存活率= ′100
TD50= Antilog[(logB+ ′C)]
式中，A≥50%藥物濃度，B≤50%藥物濃度，C= log稀釋倍數
1.2.5 乳鐵蛋白抑制試驗
為了明確BLF對HBsAg是否有抑制作用并初步判定其作用機制，我們根據國外研究文獻設計了A、B、C3種BLF處理方式[2]，試驗應用96空培養板，A、B處理方式選擇BLF的無(wú)毒劑量3.0 g/L及1.5、1.0、0.5、0.1 g/L共5個(gè)濃度進(jìn)行抗HBsAg分泌實(shí)驗，C處理方式選擇3.0、1.5、1.0、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 g/L共8個(gè)濃度進(jìn)行抗HBsAg分泌實(shí)驗，并選用干擾素a作為陽(yáng)性對照藥物，具體流程如下：
A處理方式:含BLF培養液+HBV陽(yáng)性血清 加入細胞37℃，作用120min后用PBS洗去，換正常維持液進(jìn)行培養。
B處理方式：含BLF培養液+細胞 加入HBV陽(yáng)性血清，作用120min后加正常維持液進(jìn)行培養。
C處理方式：細胞+ HBV陽(yáng)性血清 加入含BLF培養液進(jìn)行培養。
上述3種方式處理后48小時(shí)測定細胞上清液中的HBsAg。
抑制率=
1.2.6 乳鐵蛋白水解物抑制試驗
按上述C處理方式，BLF水解物采用1.0、0.5、0.1 g/L 3種濃度。
1.2.7 統計學(xué)處理
采用SAS 6.12軟件，對各組數據進(jìn)行方差分析，分析差異顯性。
2 結果
2.1 HBV病毒轉染HepG2細胞模型建立
我們發(fā)現當HBV病毒濃度＞105拷貝數/ml時(shí)，天然HBV病毒可以成功感染HepG2細胞， 48及96小時(shí)后細胞上清中均有HBsAg分泌，144小時(shí)后各組上清中HBsAg均為陰性，結果見(jiàn)表1。由于研究表明乳鐵蛋白的抗病毒作用一般發(fā)生在病毒入侵的早期[3]，因此我們選擇應用天然HBV病毒轉染HepG2細胞為模型進(jìn)行本試驗的研究，并選擇病毒載量為1′106拷貝數/ml進(jìn)行抗HBsAg分泌研究。
表1. HBV病毒轉染HepG2細胞48、96、144h后HBsAg分泌結果
|
病毒載量(拷貝數/ml)
|
108
|
107
|
106
|
105
|
104
|
103
|
|
48h后P/N值
|
62.10
|
60.79
|
22.67
|
5.56
|
1.55
|
1.26
|
|
96h后P/N值
|
53.29
|
37.29
|
8.67
|
1.61
|
1.05
|
1.06
|
|
144h后P/N值
|
各組均＜2.1
|
|||||
2.2細胞毒性測定
我們運用MTT法檢測BLF對細胞的毒性作用，經(jīng)酶聯(lián)檢測儀測定正常細胞對照平均A值為(1.338±0.033)，并將BLF濃度分別為24 g/L、12 g/L、6.0 g/L、3.0 g/L、1.5 g/L的各孔A值(n=4)計算細胞存活率分別為26.51%、47.52%、69.34%、97.47%、100%。當BLF濃度大于6 mg/ml時(shí)對細胞有毒性作用(P＜0.01),其TD50為11.08 g/L，當濃度低于3.0 g/L時(shí)對細胞無(wú)顯著(zhù)毒性作用(P＞0.05)。在本試驗中，我們選用的陽(yáng)性對照藥物干擾素a的3個(gè)濃度均對細胞無(wú)顯著(zhù)毒性作用(P＞0.05)，其細胞存活率均為100%，我們選用濃度為2 500 u/ml的干擾素a為陽(yáng)性對照。MTT檢測乳鐵蛋白水解物濃度6.0 g/L、3.0 g/L、1.5 g/L、1.0 g/L的各孔A值(n=4)計算細胞存活率分別為53.03%、75.94%、96.30%、100%，當乳鐵蛋白水解物濃度大于3.0g/L時(shí)對細胞有毒性作用(P＜0.01)，當乳鐵蛋白水解物濃度小于1.5g/L時(shí)對細胞沒(méi)有毒性作用(P＞0.05)，因此，本試驗采用1.0、0.5、0.1 g/L三個(gè)濃度。
2.3乳鐵蛋白抑制HBsAg分泌試驗
結果顯示在A(yíng)處理方式中，實(shí)驗組與陽(yáng)性對照組無(wú)顯著(zhù)差異(P＞0.05)，各組P/N值均大于2.1，細胞上清液中HBsAg均呈陽(yáng)性，表明BLF不能與HBV結合來(lái)抑制天然HBV對HepG2的感染。在B處理方式中，BLF濃度3.0、1.5、1.0、0.5 g/L組均能顯著(zhù)抑制HBsAg分泌(P＜0.05)，P/N值均低于2.1，但BLF濃度0.1 g/L組與陽(yáng)性對照組無(wú)顯著(zhù)差異(P＞0.05)。A、B處理方式結果見(jiàn)表2。
表2. A、B處理方式48小時(shí)后BLF抑制HBsAg實(shí)驗結果
|
Group
（g/L.）
|
|
A處理方式
|
|
B處理方式
|
|
|
`x±s P/N
|
`x±s P/N
|
||||
|
Positive control
|
1.225±0.021 24.50
|
1.036（1）±0.026 20.715
|
|
||
|
BLF 3.0
|
1.159±0.063 23.18
|
0.032（2）±0.007 0.645
|
|||
|
BLF 1.5
|
1.199±0.087 24.00
|
0.039（2）±0.011 0.780
|
|||
|
BLF 1.0
|
1.232±0.064 24.62
|
0.042（2）±0.015 0.835
|
|||
|
BLF 0.5
|
1.213±0.037 24.26
|
0.044（2）±0.009 0.870
|
|||
|
BLF 0.1
|
1.221±0.076 24.42
|
1.012（1）±0.022 20.245
|
|||
C處理方式結果見(jiàn)表3。結果表明實(shí)驗組各濃度BLF均能顯著(zhù)抑制HBsAg分泌(P＜0.05)，BLF濃度3.0、1.5、1.0 g/L組之間以及濃度0.2、0.3 g/L組之間無(wú)顯著(zhù)差異(P＞0.05)。
試驗所采用的BLF水解物各濃度組均不能抑制HBsAg分泌，各藥物組與陽(yáng)性對照組之間無(wú)顯著(zhù)差異(P＞0.05)。
表3. C處理方式48小時(shí)后BLF抑制HBsAg實(shí)驗結果
|
Group
（g/L.）
|
`x±s
|
P/N
|
Inhibition%
|
|
Positive control
|
1.057±0.026
|
21.14
|
|
|
BLF 3.0
|
0.44±0.014
|
8.81
|
58.34
|
|
BLF 1.5
|
0.456±0.022
|
9.13
|
56.83
|
|
BLF 1.0
|
0.504±0.031
|
10.08
|
52.33
|
|
BLF 0.5
|
0.532±0.038
|
10.64
|
49.66
|
|
BLF 0.4
|
0.605±0.078
|
12.11
|
42.73
|
|
BLF 0.3
|
0.636±0.068
|
12.72
|
39.84
|
|
BLF 0.2
|
0.684±0.109
|
13.67
|
35.32
|
|
BLF 0.1
|
0.794±0.052
|
15.88
|
24.89
|
|
IFN-a 2500(1)
|
0.685±0.051
|
13.71
|
35.16
|
注：(1) BLF單位g/L，IFN-a單位u/ml.
3 討論
根據國外對乳鐵蛋白抗病毒的研究結果，乳鐵蛋白主要在病毒感染的早期起作用，因此我們選用天然HBV病毒血清攻擊HepG2細胞方式建立模型進(jìn)行抗病毒研究。通過(guò)研究我們發(fā)現當HBV病毒濃度>105拷貝數/ml時(shí)，天然HBV病毒可以成功感染HepG2細胞，說(shuō)明天然HBV病毒可以吸附并穿刺進(jìn)入細胞，并于48 h、96 h后均可檢出HBsAg，因此該模型可以滿(mǎn)足本研究的需要，即驗證BLF的早期抗病毒效果。在病毒感染144 h后無(wú)HBsAg分泌，有研究表明這可能與HepG2細胞缺少相關(guān)的蛋白酶有關(guān)[4]，或是由于HepG2細胞的絲蛋白酶抑制劑Kazal過(guò)多表達[5]。
BLF來(lái)源于食品，與現有抗乙型肝炎病毒藥物相比，其安全無(wú)毒，來(lái)源廣泛。本研究通過(guò)乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒對反應結果進(jìn)行診斷，具有快速、靈敏、準確、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，并選取BLF對HepG2細胞的無(wú)毒作用濃度，采用A、B、C三種方式進(jìn)行給藥結果顯示在A(yíng)處理方式中，BLF各個(gè)濃度均不能抑制HBsAg分泌(P＞0.05)，說(shuō)明BLF不能通過(guò)與HBV病毒結合來(lái)抑制病毒對HepG2細胞的感染。在B處理方式中，所選用的BLF濃度大于0.5 g/L均能顯著(zhù)抑制HBsAg分泌(P＜0.05),實(shí)驗各組HBsAg分泌均呈陰性，說(shuō)明BLF可以通過(guò)與HepG2細胞某位點(diǎn)結合來(lái)阻斷天然HBV病毒對HepG2細胞的感染，這
與國外報道結果相一致[2]。McAbee等人報道BLF可以與大鼠肝臟細胞的脫唾液酸糖蛋白位點(diǎn)結合[6]，而該位點(diǎn)可能是HBV病毒的入侵位點(diǎn)[7]，因此這可能是BLF對HBV病毒的預
防抑制機制。在C處理方式中，BLF各濃度均能顯著(zhù)抑制HBsAg分泌(P＜0.05)，其中
3.0 g/L（1）組抑制率最高為58.34%，這說(shuō)明當HBV已經(jīng)侵入HepG2細胞后，BLF仍可以抑制HBsAg分泌，但將BLF水解后，水解物對HBsAg無(wú)顯著(zhù)抑制作用，說(shuō)明BLF對HBsAg的抑制作用取決于BLF的空間結構而不是特有的某個(gè)肽鏈區域。彭志高等[8]利用時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)定量檢測乙型肝炎表面抗原，并用實(shí)時(shí)FQ-PCR定量檢測HBV-DNA，定量結果表明兩者具有很好的相關(guān)性，因此我們推測BLF對HBV-DNA也有相同的抑制作用，但其抑制HBsAg分泌作用機理尚不明確，這還需要我們做進(jìn)一步的研究,以確定乳鐵蛋白的抗HBV機制，為其得到更廣泛的應用奠定理論基礎。
參考文獻
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7 TREICHEL U, MEYER ZUMBUSCHENFELDE KH,DIENES HP, et al. Receptor-mediated entry of hepatitis B virus particles into liver cells[J]. Arch Virol, 1997,142:493-498.
8 彭志高，廖可育. 乙型肝炎病毒標志物定量檢測與HBV定量關(guān)系的研究[J]. 實(shí)用預防醫學(xué), 2005,12(5):1142-1143. 收稿日期：
作者簡(jiǎn)介：李松濤，男(1981-)，在讀碩士研究生，研究方向：營(yíng)養學(xué)與保健食品。lisongtaoklds@126.com
通信作者：劉寧，男(1960-)，醫學(xué)博士，教授，研究方向：營(yíng)養與食品安全。Tel：0451-55191827， Fax：0451-55190340，E-mail：ningliu6666@yahoo.com.cn
基金項目：黑龍江省普通高校骨干教師創(chuàng )新能力資助計劃(1055G004)
1哈爾濱醫科大學(xué)流行病學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱，150081)
論著(zhù)
食物誘導的脂代謝紊亂對機體糖代謝及炎癥因子的影響
王艷莉 翟成凱[1] 陳晗 王曉飛
東南大學(xué)公共衛生學(xué)院，南京 210009
摘要：目的 通過(guò)觀(guān)察大鼠脂代謝紊亂過(guò)程中糖代謝及相關(guān)炎癥因子的變化，探討脂代謝紊亂對糖代謝及炎癥因子的作用。方法 20只雄性SD大鼠隨機分為對照組、脂代謝紊亂組，以相應飼料連續喂養17周，檢測實(shí)驗前后大鼠TC、TG、HDL-C、TNF-α和IL-6，并分別于實(shí)驗第0周、5周、11周、17周取血檢測FPG、FINS和hs-CRP。結果 與對照組相比，脂代謝紊亂組大鼠的血清TC、TG、FINS、hs-CRP和IL-6水平顯著(zhù)升高（P＜0.05），ISI顯著(zhù)降低（P＜0.05）。結論 高脂食物成功誘導大鼠脂代謝紊亂模型的建立，脂代謝紊亂促使機體FINS升高及ISI下降，炎癥因子在糖脂代謝紊亂發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作為促發(fā)因素，直接介導胰島素抵抗的發(fā)生，加重糖代謝紊亂。
關(guān)鍵詞：脂代謝紊亂 糖代謝 炎癥因子
中圖分類(lèi)號： 文獻標識碼：
Effects of lipid dysmetabolism on glycometabolism and
inflammatory factors in rats induced by high-fat diets
WANG Yan-li, ZHAI Cheng-kai, CHEN Han, WANG Xiao-fei, et al.
School of Public Health, Southeast University (Nanjing 210009), China
Abstract Objective To investigate the changes of glycometabolism and inflammatory factors of the lipid dysmetabolism processing in rats, and to explore the effects of lipid dysmetabolism on glycometabolism and inflammatory factors .Methods 20 male SD rats were divided into 2 groups: the control group and the lipid dysmetabolism group. After feeding the rats for17 weeks respectively, then body weight、TC、TG、HDL-C、TNF-α and IL-6 were measured, and the serum FPG、FINS and hs-CRP were detected in the 5th ,11th ,17th week respectively. Results Compared with the control group, the serum TC、TG、FINS、hs-CRP and IL-6 were increased significantly in the lipid dysmetabolism group , and the ISI levels were decreased in the lipid dysmetabolism group（P＜0.05).Conclusion The rats induced by high-fat diets were developed to the lipid dysmetabolism model , the lipid dysmetabolism impeled the organism of the FINS increased and the ISI decreased, the inflammatory factors as a precipitating factor in the development of lipid dysmetabolism processing, it can mediate the generation of insulin resistance directly and aggravate the glycometabolism ultimately.
Key words: lipid dysmetabolism ; glycometabolism ;Inflammatory factors
糖尿病是由多種病因引起的內分泌代謝疾病，長(cháng)期以來(lái)患者體內血脂代謝異常被認為是繼發(fā)于糖代謝紊亂。近來(lái)，McGarry和Taskinen等提出了脂代謝異常為2型糖尿病的原發(fā)性病理生理事件[1，2]，并提議將糖尿病改為“糖脂病(Diabetes Mellipitus)”。同時(shí)，多項研究也表明糖脂代謝紊亂患者體內伴隨著(zhù)慢性炎癥反應。目前多數研究集中在機體單一糖代謝或脂代謝紊亂與炎癥因子之間的關(guān)系，而由食物誘導的機體脂代謝紊亂對糖代謝與炎癥因子共同作用的研究較少。本研究旨在以高脂飼料喂養大鼠誘導脂代謝紊亂，在檢測總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的基礎上，同時(shí)觀(guān)察空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）及超敏C反應蛋白（hs-CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的水平, 并以胰島素敏感指數(ISI)判定機體胰島素抵抗狀態(tài)，探討脂代謝紊亂對糖代謝及炎癥因子的作用，為糖尿病和血脂異常的發(fā)病機制與臨床防治提供參考依據。
1 材料與方法
1.1飼料配制
飼料配方參考AIN-93G國際配方[3]，高脂飼料中添加豬油、蛋黃粉、膽鹽等，兩組飼料主要成分及三大營(yíng)養素的供能比見(jiàn)表1。
表1 兩組飼料主要成分及三大營(yíng)養素的供能比(100g)
Table1 Composition of two diets and proportion of three nutriments for energy(100g)
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飼料類(lèi)型
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酪蛋白（g）
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油脂(1)（g）
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玉米淀粉（g）
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蔗糖（g）
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蛋黃粉（g）
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膽鹽（g）
|
膽固醇（g）
|
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對照飼料
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23
|
5
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32
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31.0
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0
|
0
|
0
|
|
高脂飼料
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20
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10
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29
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25.3
|
5
|
0.2
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1.5
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飼料類(lèi)型
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混合礦物鹽(2)（g）
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混合維生素(3)（g）
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纖維素（g）
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總能量（kJ）
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蛋白質(zhì)供能比（%）
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脂肪供能比（%）
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碳水化合物供能比（%）
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對照飼料
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3.5
|
1
|
4
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1566.99
|
24.98
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12.02
|
63.01
|
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高脂飼料
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3.5
|
1
|
4
|
1631.42
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21.66
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26.41
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51.93
|
注：(1)每100g對照飼料含有豆油5g，每100g高脂飼料含有豬油10g。
(2)混合礦物鹽（g/kg混合物）：磷酸二氫鉀250g,氯化鈉74g,，硫酸鉀46.6g,，枸櫞酸鉀(單結晶水)28g， 氧化鎂24g，枸櫞酸鐵6.06g，碳酸鋅1.65g，碳酸錳0.63g，碳酸銅0.3g，碘化鉀0.01g，硒酸鈉0.01025g，對鉬酸胺0.00795g，偏硅酸鈉(9個(gè)結晶水)1.45g，硫酸鉀鉻(12個(gè)結晶水)0.275g，硼酸0.0815g，氟化鈉0.0635g，碳酸鎳0.315g，氯化鋰0.0174g，釩酸胺0.0066g，碳酸鈣400g，加蔗糖使混合物至1000g.。
(3)混合維生素（g/kg混合物）：煙酸3g，泛酸鈣1.6g，鹽酸吡哆醇0.7g，鹽酸硫胺素0.6 g，維生素B20.6g，葉酸0.2g，生物素0.02g，維生素B122.5g，維生素E(500IU/G)15g，維生素A(棕櫚酸鹽50 0000IU/g)0.8g，VitD3(40 0000IU/g)0.25，維生素K0.075g，加蔗糖至1000g。
1.2實(shí)驗動(dòng)物及分組
清潔級近交系雄性SD大鼠20只，體重330～350g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗動(dòng)物中心，許可證號：SCXK（滬）2003－0003。實(shí)驗前適應性喂養一周后，隨機分為對照組和脂代謝紊亂組，每組10只，分別飼以對照飼料和高脂飼料。動(dòng)物自由攝食，連續喂養17周。
1.3指標的檢測
（1）實(shí)驗期間每周稱(chēng)量大鼠體重，實(shí)驗前后檢測TC、TG、HDL-C、TNF-α和IL-6，并分別于實(shí)驗第0周、5周、11周、17周檢測FPG、FINS和hs-CRP，對其進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀(guān)察。hs-CRP試劑盒為美國Rapid Bio Lab公司產(chǎn)品；FINS、TNF-α、IL-6試劑盒為北京科美東雅生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TC、TG、HDL-C試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。
（2）以ISI判定機體胰島素抵抗狀態(tài)，ISI=-log(FPG×FINS)。
1.4 數據處理
采用SAS 8.0統計軟件進(jìn)行數據處理，實(shí)驗前后同組指標比較用配對t檢驗，組間比較采用DUNNET-t檢驗，差異顯著(zhù)性設定為P＜0.05。
2 結果
2.1高脂飼料對實(shí)驗大鼠脂代謝的影響（表2）
表2 高脂飼料對實(shí)驗大鼠血脂的影響 ( ±s，n=10)
Table2 Effects on the blood lipids of the rats induced by high-fat diets
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組別
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時(shí)間
|
TC（mmol/L）
|
TG（mmol/L）
|
HDL-C（mmol/L）
|
|
對照組
|
實(shí)驗前
|
1.86±0.31
|
1.52±0.29
|
1.16±0.14
|
|
對照組
|
實(shí)驗后
|
1.88±0.28(1)
|
1.59±0.56(1)
|
1.18±0.20(1)
|
|
脂代謝紊亂組
|
實(shí)驗前
|
1.87±0.31
|
1.65±0.37
|
1.18±0.19
|
|
脂代謝紊亂組
|
實(shí)驗后
|
3.26±0.56(1,2)
|
2.46±0.35(1,2)
|
0.55±0.11(1,2)
|
注：（1）與實(shí)驗前相比P＜0.05；（2）與對照組相比 P＜0.05。
由表2可知，實(shí)驗前兩組大鼠的TC、TG和HDL-C水平未見(jiàn)顯著(zhù)性差異（P＞0.05），實(shí)驗后脂代謝紊亂組大鼠血清TC、TG水平顯著(zhù)高于對照組（P＜0.05），HDL-C水平顯著(zhù)低于對照組（P＜0.05），證明大鼠脂代謝紊亂造模成功。
2.2脂代謝紊亂對大鼠體重及糖代謝的影響（表3）
表3 脂代謝紊亂對大鼠體重及糖代謝的影響( ±s，n=10)
Table3 Effects on body weight and glycometabolism of the lipid dysmetabolism
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組別
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時(shí)間
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體重（g）
|
FPG（mmol/L）
|
FINS（mIU/ml）
|
ISI
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|
對照組
|
實(shí)驗前
|
329.4±18.7
|
4.06±0.52
|
14.37±3.11
|
-4.04±0.31
|
|
|
實(shí)驗后
|
489.8±20.9(1)
|
5.32±0.78(1)
|
26.23±7.27(1)
|
-4.89±0.40(1)
|
|
脂代謝紊亂組
|
實(shí)驗前
|
329.1±17.3
|
4.17±0.57
|
16.98±4.09
|
-4.22±0.35
|
|
|
實(shí)驗后
|
577.4±22.9(1,2)
|
6.49±1.62(1)
|
50.20±5.83(1,2)
|
-5.76±0.19(1,2)
|
注：（1）與實(shí)驗前相比P＜0.05；（2）與對照組相比P＜0.05。
由表3可知，實(shí)驗前兩組大鼠的體重、FPG、FINS和ISI水平未見(jiàn)顯著(zhù)性差異（P＞0.05），實(shí)驗后脂代謝紊亂組大鼠體重和FINS與對照組相比顯著(zhù)升高（P＜0.05），ISI與對照組相比顯著(zhù)降低（P＜0.05）。
2.3脂代謝紊亂對炎癥因子的影響（表4）
表4 脂代謝紊亂對hs-CRP、TNF-α和IL-6的影響( ±s，n=10)
Table 4 Effects on hs-CRP、TNF-α and IL-6 of the lipid dysmetabolism
|
組別
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時(shí)間
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hs-CRP (ug/ml)
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TNF-α（ng/ml）
|
IL-6（pg/ml）
|
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對照組
|
實(shí)驗前
|
104.90±15.88
|
0.52±0.16
|
41.36±11.97
|
|
對照組
|
實(shí)驗后
|
186.23±46.01(1)
|
0.78±0.24(1)
|
46.99±17.73(1)
|
|
脂代謝紊亂組
|
實(shí)驗前
|
106.73±12.57
|
0.54±0.36
|
42.77±15.12
|
|
脂代謝紊亂組
|
實(shí)驗后
|
368.36±87.70(1,2)
|
1.15±0.71(1)
|
82.16±20.46(1,2)
|
注：（1）與實(shí)驗前相比P＜0.05；（2）與對照組相比 P＜0.05。
由表4可知，實(shí)驗前兩組大鼠的hs-CRP、TNF-α和IL-6水平未見(jiàn)顯著(zhù)性差異（P＞0.05），實(shí)驗后脂代謝紊亂組血清hs-CRP、IL-6水平顯著(zhù)高于對照組（P＜0.05）。
2.4 兩組大鼠體重、FPG、FINS、ISI、hs-CRP的動(dòng)態(tài)變化趨勢（圖1）
由圖1可知，實(shí)驗前兩組大鼠的體重、hs-CRP、FPG、FINS、ISI未見(jiàn)顯著(zhù)性差異（P＜0.05），隨著(zhù)高脂飼料不斷攝入，5周后脂代謝紊亂組大鼠體重明顯上升，而對照組體重上升的幅度較小；實(shí)驗第5周，兩組血清FINS、hs-CRP水平均有一定程度的升高，脂代謝紊亂組血清FINS、hs-CRP較對照組上升幅度更大（P＜0.05），至第11周， FINS、hs-CRP進(jìn)一步升高，而對照組自第11周起FINS較為穩定、hs-CRP緩慢上升，兩組間FPG水平接近，脂代謝紊亂組ISI水平低于對照組（P＜0.05），且保持此趨勢至實(shí)驗結束。
注：1、體重單位為g；FINS單位為mIU/ml；hs-CRP單位為ug/ml；FPG單位為mmol/L。
2、大鼠體重及hs-CRP值均縮小10倍，H為脂代謝紊亂組，C為對照組。
圖1 兩組大鼠體重、FINS 、hs-CRP、FPG及ISI的動(dòng)態(tài)變化趨勢
Chart1 Dynamic trend on the body weight、FINS、hs-CRP 、FPG 、ISI of the rats
3 討論
3.1飲食誘導的脂代謝紊亂動(dòng)物模型的建立
脂代謝紊亂是許多代謝性疾病的一個(gè)重要特征，本實(shí)驗通過(guò)喂飼大鼠高脂飼料誘導脂代謝紊亂模型，結果顯示17周后脂代謝紊亂組大鼠體重顯著(zhù)高于對照組，血清TC、TG、FINS水平比對照組顯著(zhù)升高，而HDL-L顯著(zhù)降低，同時(shí)ISI比對照組顯著(zhù)降低，差異均具有統計學(xué)意義（P＜0.05）。根據文獻報告[4,5]，一般高脂飼料喂飼大鼠4周以上，血清TC、TG、和HDL-C水平與同時(shí)喂飼普通飼料的對照組大鼠血清相應的指標相比較，可以產(chǎn)生顯著(zhù)差異（P＜0.05），從而確定脂代謝紊亂造模成功。本實(shí)驗中高脂飼料誘導大鼠脂代謝紊亂模型的建立，并具有高胰島素血癥的特點(diǎn)，與人類(lèi)糖脂代謝紊亂的特點(diǎn)極為相似。
3.2脂代謝紊亂對機體糖代謝的影響
隨著(zhù)高脂飼料不斷攝入，脂代謝紊亂組大鼠體重明顯上升。由圖1可知，脂代謝紊亂組大鼠血清FINS水平比對照組增長(cháng)更快，第11周FINS進(jìn)一步升高，而對照組至11周FINS水平較為穩定。實(shí)驗結果顯示，實(shí)驗后脂代謝紊亂組大鼠ISI顯著(zhù)降低（P＜0.05）。Matthias B發(fā)現，在胰島素抵抗患者血漿中，血管緊張素-2、TNF-α沒(méi)有升高，而游離脂肪酸(FFA)顯著(zhù)升高[6]，提示FFA升高是胰島素抵抗狀態(tài)中首先出現的代謝異常。已有研究表明，脂代謝紊亂大鼠的血清及組織中FFA濃度顯著(zhù)升高[7]，由于過(guò)量FFA在肌肉、肝臟、脂肪組織中儲留，能夠降低胰島素作用下骨骼肌和脂肪組織對葡萄糖的吸收作用，改變對胰島素敏感的組織葡萄糖轉變規律[8]，引起胰島β細胞分泌功能異常, 因此脂代謝紊亂能夠影響胰島素的分泌，進(jìn)而導致整個(gè)機體糖代謝紊亂。此外，膳食中碳水化合物成分又刺激肝臟脂肪的生成，使血清中TG水平升高，進(jìn)一步導致脂代謝紊亂加重，形成惡性循環(huán)。因此，脂代謝紊亂是糖代謝紊亂的原發(fā)性病理事件。
3.3脂代謝紊亂對炎癥因子的影響
本文結果顯示，實(shí)驗后脂代謝紊亂組大鼠血清hs-CRP、IL-6水平顯著(zhù)高于對照組（P＜0.05），由圖1hs-CRP的動(dòng)態(tài)變化趨勢可見(jiàn)，脂代謝紊亂組hs-CRP上升的幅度顯著(zhù)高于對照組（P＜0.05），隨著(zhù)體重的增加，脂代謝紊亂組大鼠血清hs-CRP始終保持較高水平，而對照組自11周起hs-CRP緩慢上升，說(shuō)明脂代謝紊亂組大鼠體內由于脂肪過(guò)多而處于低度慢性損傷狀態(tài)。hs-CRP是急性期反應蛋白，為非特異性炎癥標志物,其合成受激活的單核細胞、成纖維細胞及某些細胞因子如TNF-α和IL-6等的調節，而這些細胞因子均由脂肪細胞高度分泌[9]。由于高脂飼料喂養易引起大鼠脂肪堆積，使得炎癥因子IL-6和TNF-α釋放增多，胰島β細胞功能受損，胰島素生理作用被抑制，進(jìn)而導致肝細胞hs-CRP合成增加[10]。同時(shí)，TNF-α和IL-6還可通過(guò)抑制胰島素受體酪氨酸激酶活性，降低胰島素依賴(lài)的葡萄糖轉運分子Glut4的表達[11]，以及加速脂肪分解，導致FFA水平增加等，引起外周組織的胰島素抵抗，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子hs-CRP的產(chǎn)生，由此推斷hs-CRP和IL-6等炎癥因子是糖脂代謝紊亂發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的促發(fā)因素，可通過(guò)多種途徑影響糖脂代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗中兩組TNF-α水平無(wú)顯著(zhù)性差異，與劉海龍等研究結果一致[12]，但脂代謝紊亂組大鼠相對于對照組大鼠呈胰島素抵抗狀態(tài)，推測在胰島素抵抗狀態(tài)的初期不伴有TNF-α的濃度升高，關(guān)于脂代謝紊亂中TNF-α介導胰島素抵抗的機制，還需要深入的研究。
本實(shí)驗中隨著(zhù)高脂食物的攝入，脂代謝紊亂組大鼠體內形成脂肪堆積，分解釋放的炎癥因子增加，直接介導胰島素抵抗的發(fā)生，加重糖代謝紊亂，因此hs-CRP、IL-6等炎癥因子是糖脂代謝紊亂發(fā)生的促發(fā)因素。臨床工作中可將炎癥因子hs-CRP、IL-6作為血脂異常、糖尿病等的監測指標，從而預測營(yíng)養相關(guān)慢性病的發(fā)生和發(fā)展。
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