達能營(yíng)養中心在全球
青年科學(xué)工作者論壇2007年第3期
《衛生研究》--2007年第三期
論著(zhù)
補鈣對12~17歲青少年鋅、鐵吸收率的影響
尹婧 張倩 王曉燕 杜維婧 王筱桂 李衛東 胡小琪 馬冠生[1]
中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所，北京 100050
摘要：目的 通過(guò)代謝平衡實(shí)驗探討補鈣對中國青春期少年鋅、鐵吸收率的影響。方法 從320名參加1年補鈣實(shí)驗的4組12~17歲少年中，每組隨機抽取男、女生各10人，共80人。采用代謝平衡的方法，收集研究對象10天內攝入的食品、排出的糞便和尿液樣品，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測定樣品中的鈣、鐵、鋅含量。結果 不同補鈣組之間鈣攝入量有差異，但鐵、鋅攝入量差異沒(méi)有顯著(zhù)性。不同補鈣組之間鈣、鐵、鋅的表觀(guān)吸收率差異無(wú)顯著(zhù)性。男生鈣、鐵、鋅的表觀(guān)吸收率平均為69.4%、12.5%和29.9%，女生的分別為46.4%、20.9%和35.3%。鐵的表觀(guān)吸收率與青春發(fā)育水平有關(guān)。男生鈣攝入量為600~800mg/d時(shí)，鈣、鐵、鋅的表觀(guān)吸收率均處于相對較高水平（75.3%、23.2%和36.4%）。結論 鈣攝入量低于1400mg/d時(shí)，不影響12~17歲少年鋅、鐵的吸收率。當男生鈣攝入量為600~800mg/d時(shí)，更有助于鈣、鐵、鋅的吸收。
中圖分類(lèi)號：R151.42 R153.2 文獻標識碼：A
Effect of calcium supplementation on absorption rate of zinc and iron in 12-17 years old adolescents
YIN Jing, ZHANG Qian, DU Wei-jing, WANG Xiao-yan, et al.
Institute for Nutrition and Food Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China
Abstract: Objective To study the effect of calcium supplementation on absorption rate of zinc and iron by calcium metabolic balance study. Methods A total of 80 students (12-17 years old) were selected randomly from 320 subjects who had been supplemented with calcium supplementation for one year. 10 boys and 10 girls were randomly selected from each calcium supplementation group to attend a 10-day metabolic balance study. Samples of foods, feces and urine were collected. Calcium, zinc and iron in samples were measured with ICP-AES. Results There were significant differences of calcium intake, but were no differences of iron and zinc intake for 4 groups. The apparent absorption rate of calcium, iron and zinc in boys and girls were 69.4%, 12.5%, 29.9% and 46.4%, 20.9%, 35.3%, respectively. Absorption rates of iron were associated with pubertal stages. There were no significant differences of absorption of calcium, iron and zinc for 4 groups. Apparent absorption rates of calcium, iron and zinc seemed higher (75.3%, 23.2% and 36.4%) when the level of calcium intake were 600-800mg/d in boys. Conclusion There were no significant effects on absorption rate of iron and zinc when the level of calcium intake was 1400mg/d in 12-17 years old Chinese adolescents. Absorption rates of calcium, iron and zinc seemed higher when the level of calcium intake was 600-800mg/d in boys.
Key words: calcium supplementation, zinc and iron absorption rate, adolescent
2002年中國居民營(yíng)養與健康狀況調查發(fā)現，中國居民鈣攝入量平均為388.8mg/d[1]，遠遠低于中國的鈣膳食參考攝入量（dietary reference intakes，DRIs）。與國外人群相比，中國骨質(zhì)疏松癥的患病率也比較低[2]，因此中國居民的鈣需要量可能低于國外其他種族人群的需要量。因此十分有必要依據中國青少年的鈣代謝特點(diǎn)，制定中國青少年的鈣DRIs。
在制定人體的鈣需要量時(shí)，不僅要考慮鈣攝入量對骨量的影響，也要考慮高鈣攝入對其他礦物質(zhì)元素代謝的影響，如鐵和鋅是維持人類(lèi)健康的必需微量元素，他們的缺乏一直是一個(gè)全球關(guān)注的問(wèn)題，尤其是發(fā)展中國家的婦女和兒童鐵和鋅的缺乏[3]。膳食中鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)吸收利用可能存在復雜的相互作用[4]。而目前中國通過(guò)人體代謝的方法探討青少年攝入的多種礦物間相互影響的研究還比較少。本研究通過(guò)代謝平衡法，分析了中國12~17歲補鈣少年鈣、鐵、鋅的代謝特點(diǎn)，探討了不同鈣攝入水平下，機體對鈣、鐵、鋅的吸收利用狀態(tài)，為制定符合中國青春期少年代謝特點(diǎn)的鈣DRIs提供科學(xué)依據。
1 對象與方法
1.1 研究對象及分組
本次鈣代謝平衡研究是對研究對象進(jìn)行1年補鈣干預試驗后開(kāi)展。補鈣試驗將從北京市某中學(xué)（15.1±0.8）歲學(xué)生抽取的320人隨機分為4組，男女各半。補鈣干預分組為：第1組（日常膳食組＋碳酸鈣63mg/d），第2組（日常膳食組＋碳酸鈣354mg/d），第3組（日常膳食組＋碳酸鈣660mg/d），第4組（日常膳食組＋碳酸鈣966mg/d）。
進(jìn)行鈣代謝平衡實(shí)驗時(shí)，從每個(gè)補鈣組中隨機抽取男、女生各10人，共80人參與鈣代謝研究。所有參與者具備以下條件：自愿參加，身體健康，沒(méi)有患影響骨代謝的肝、腎疾病和骨骼系統疾病。
本研究經(jīng)中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所倫理評審委員會(huì )同意，并由家長(cháng)簽署了知情同意書(shū)。
1.2 問(wèn)卷調查及體格測量
通過(guò)面對面詢(xún)問(wèn)調查是否出現首次遺精和月經(jīng)初潮及出現的時(shí)間。由經(jīng)過(guò)培訓的調查員采用標準的方法測量身高、體重和Tanner分期。
1.3 代謝實(shí)驗
共10天，前3天為適應期，后7天為實(shí)驗期。代謝實(shí)驗期間，研究對象仍然按照補鈣干預的分組服用鈣片。收集調查對象10天的飲食（包括三餐、零食和飲用水）、24h糞便和尿樣。
1.3.1 實(shí)驗膳食的給予與收集：以全國大規模營(yíng)養調查為依據，并結合當地飲食習慣和市場(chǎng)供應時(shí)令蔬菜情況，設計3天食譜，實(shí)驗期內重復使用。每天由經(jīng)過(guò)培訓的調查員準確稱(chēng)量和記錄每人各種食物的凈攝入量。收集每種食物樣品，用不銹鋼食品打碎機制備均勻樣品，置于-20℃冰箱中保存。
1.3.2 現場(chǎng)人體代謝實(shí)驗和流程：采用集中食宿，受試者不能食用實(shí)驗提供食物以外的任何食物和飲料。先給實(shí)驗對象3天的實(shí)驗膳食適應，然后以3天為1個(gè)食譜周期，食用7天的實(shí)驗膳食。
1.3.3 糞便和尿液的收集：第4天和第11天早餐前分別服用卡紅膠囊2粒（200mg）以標記糞便。自糞便出現紅色染料（卡紅）起，收集每個(gè)受試對象的全部糞便，直至D11服用的紅色染料在糞便中出現為止。糞便每24h收集1次，記錄糞便重量和兌入水的重量，用不銹鋼食品打碎機混勻樣品后，-20℃保存。收集研究對象實(shí)驗期每天24h的全部尿液，加入1%鹽酸溶液，混勻稱(chēng)量后，-20℃保存。
1.3.4樣品的測定：糞便和尿樣按照10%的平行樣，食物全部取雙份樣品，以豬肉粉（國家標準物質(zhì)研究所）為標準物質(zhì)，經(jīng)濕法消化后，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-AES）（Optima 3000，美國PE公司）測定樣品中的鈣、鐵、鋅含量。
1.4 統計分析
數據錄入后進(jìn)行核對、清理。根據數據類(lèi)型，采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗比較補鈣組間差異，采用Spearman相關(guān)分析吸收率與其他因素的相關(guān)性。將鈣攝入量和鈣、鐵、鋅的吸收率進(jìn)行曲線(xiàn)擬合。表觀(guān)吸收率的計算公式如下：
2 結果
2.1 一般情況
有5名男生和2名女生的代謝樣品收集不全，依從性不好，將這7人從總體中剔除。研究對象的年齡為12~17歲，各補鈣組之間的年齡、身高、體重、BMI差異無(wú)顯著(zhù)性，均衡性比較好。代謝實(shí)驗時(shí)87.7%的研究對象已經(jīng)歷月經(jīng)初潮或首次遺精，各組間達到Tanner 4期和5期的人數比例沒(méi)有顯著(zhù)差異。見(jiàn)表1。
表 1 研究對象的一般情況
Table1 The characteristics of the subjects
|
性別
|
組別
|
n
|
年齡
(歲)
|
身高
(cm)
|
體重
(kg)
|
BMI
|
n1(1)
|
|
男生
|
第1組
|
9
|
15.3±0.7
|
167.3±8.6
|
63.6±18.6
|
22.6±6.1
|
7
|
|
第2組
|
10
|
15.5±0.5
|
169.0±5.2
|
57.7±9.2
|
20.2±2.4
|
9
|
|
|
第3組
|
9
|
15.3±0.5
|
170.4±9.8
|
59.8±6.2
|
20.7±2.5
|
5
|
|
|
第4組
|
7
|
15.2±0.7
|
166.4±5.1
|
56.8±13.4
|
20.3±3.5
|
5
|
|
|
P
|
|
0.731
|
0.729
|
0.704
|
0.551
|
0.421
|
|
|
女生
|
第1組
|
10
|
14.6±1.1
|
159.0±5.6
|
53.3±12.1
|
20.9±3.6
|
6
|
|
第2組
|
8
|
14.9±0.8
|
157.9±6.5
|
52.7±10.7
|
21.0±3.1
|
4
|
|
|
第3組
|
10
|
15.0±1.1
|
159.0±6.0
|
52.5±6.3
|
20.7±2.1
|
7
|
|
|
第4組
|
10
|
14.7±0.8
|
159.9±6.1
|
51.1±6.7
|
19.9±1.7
|
4
|
|
|
P
|
|
0.789
|
0.918
|
0.961
|
0.826
|
0.581
|
注：（1）n1：Tanner4期和5期人數，（2）單因素方差分析，χ2檢驗
2.2 鈣、鐵、鋅的攝入量
由表2可見(jiàn)，通過(guò)服用鈣片，不同補鈣組之間每日總鈣攝入量差異有顯著(zhù)性，最低組為352.44mg，最高組為1313.29mg。但不同補鈣組之間鐵、鋅攝入量差異不顯著(zhù)，男生的鐵、鋅攝入量均高于女生（P<0.05）。
表 2 補鈣4組間鈣、鐵、鋅代謝情況的比較
Table 2 Comparison on metabolism of Ca,Fe and Zn between 4 groups of Ca supplementation
|
性別
|
組別
|
攝入量（mg/d）
|
吸收率(%)(1)
|
||||
|
鈣
|
鐵
|
鋅
|
鈣
|
鐵
|
鋅
|
||
|
男生
|
第1組
|
427.1±48.2
|
14.6±4.5
|
9.7±2.2
|
69.3
|
12.1
|
24.8
|
|
第2組
|
723.6±64.6
|
14.9±4.4
|
9.7±2.7
|
75.3
|
23.2
|
36.4
|
|
|
第3組
|
1002.3±46.2
|
13.6±4.1
|
9.1±1.9
|
71
|
10.7
|
34.8
|
|
|
第4組
|
1313.3±80.4
|
14.2±4.3
|
9.1±2.7
|
61.3
|
2.7
|
22.9
|
|
|
合計
|
809.0±357.0
|
9.4±1.6
|
8.0±1.2
|
46.4
|
12
|
30.3
|
|
|
P
|
0.000
|
0.938
|
0.899
|
0.251
|
0.315
|
0.325
|
|
|
女生
|
第1組
|
352.4±51.3
|
9.6±1.6
|
8.4±1.3
|
55
|
22.5
|
43.7
|
|
第2組
|
619.9±40.9
|
8.6±1.5
|
7.3±1.1
|
47.6
|
19.8
|
31.6
|
|
|
第3組
|
965.6±39.1
|
9.9±1.6
|
7.9±0.8
|
43
|
23.2
|
33.4
|
|
|
第4組
|
1260.2±40.8
|
9.2±1.3
|
8.4±1.3
|
40.4
|
18.1
|
31.8
|
|
|
合計
|
838.9±327.9
|
14.3±4.2
|
9.5±2.3
|
68.7
|
20.8
|
34.5
|
|
|
P
|
0.000
|
0.306
|
0.205
|
0.136
|
0.834
|
0.138
|
|
注：（1）單因素方差分析，Kruskal-Wallis檢驗
2.3 鈣、鐵、鋅的表觀(guān)吸收率
不同補鈣組之間鈣、鐵、鋅的表觀(guān)吸收率差異無(wú)顯著(zhù)性。觀(guān)察吸收率隨鈣攝入量的變化趨勢圖發(fā)現，男生鈣、鐵、鋅的表觀(guān)吸收率隨著(zhù)鈣攝入量的增加呈先上升后下降的趨勢，鈣攝入量為600~800mg/d時(shí)，鈣、鐵、鋅的表觀(guān)吸收率均處于比較高的水平。女生鈣的表觀(guān)吸收率隨著(zhù)鈣攝入量的增加整體呈下降趨勢，但鐵、鋅的表觀(guān)吸收率比較穩定。見(jiàn)表2和附圖。
附圖 鈣、鐵、鋅的吸收率隨鈣攝入量的變化
Figure Trend of absorption rate of calcium, zinc and iron followed calcium intakes
2.4 鈣、鐵、鋅的表觀(guān)吸收率與鈣攝入量和青春期發(fā)育水平的關(guān)系
通過(guò)Spearman相關(guān)分析發(fā)現，鈣的表觀(guān)吸收率與性別（r=0.64，P<0.05）、鈣攝入量（r=-0.24，P<0.05）有關(guān)，男生的鈣表觀(guān)吸收率高于女生，隨著(zhù)鈣攝入量的增加，鈣表觀(guān)吸收率總體呈下降趨勢。但鐵、鋅的表觀(guān)吸收率與性別、鈣攝入量無(wú)關(guān)。鐵的表觀(guān)吸收率與青春發(fā)育水平呈顯著(zhù)正相關(guān)（r=0.24，P<0.05）。
3 討論
在本研究開(kāi)始前，研究對象已經(jīng)參與1年的碳酸鈣補充實(shí)驗，各補鈣組的鈣代謝情況已經(jīng)比較穩定。不同補鈣組之間的BMI水平及青春發(fā)育情況無(wú)差異，便于進(jìn)行組間比較。
3.1 鐵、鋅攝入量與吸收率
2002年中國居民營(yíng)養與健康狀況調查顯示，中國14~17歲少年的鐵攝入量：男性23.0mg/d、女性20.5mg/d，鋅攝入量：男性11.7mg/d、女性10.0mg/d[5]。本次調查的研究對象鐵、鋅攝入量都沒(méi)有達到中國的DRIs標準[6]，低于全國水平，其中鐵攝入量尤為低。除了研究對象不同，存在地區性差異，更可能的原因是這2項研究對膳食營(yíng)養素分析的方法不同。全國調查利用的是膳食回顧法、食物稱(chēng)重記帳法和食物頻率法，而本研究通過(guò)稱(chēng)重法獲得研究對象的進(jìn)食量，并直接測定樣品中的鈣、鐵、鋅，得到的鈣、鐵、鋅攝入量相對更準確。
有研究發(fā)現4~6歲學(xué)齡前兒童代表性膳食中鐵的吸收率為6.10%[7]，鋅的吸收率為12.94%[8]。24歲丹麥婦女進(jìn)食一般膳食時(shí)，非血紅素鐵的吸收率為7.4%[9]。通過(guò)口服同位素評價(jià)藏族18歲青年男子膳食鐵的吸收率為13.4%[10]。本研究發(fā)現，鐵的吸收率與青春發(fā)育水平有關(guān)，而且低劑量補鈣組少年的鐵、鋅的吸收率比較高，達到23.2%和36.4%，可能由于研究對象多數人出現過(guò)月經(jīng)初潮或首次遺精，正處于青春發(fā)育后期，對鐵、鋅的需要量比較高，而膳食鐵、鋅攝入量比較低引起的。
3.2 補鈣對鐵、鋅吸收率的影響
食物中帶有相似化學(xué)結構的營(yíng)養素在高攝入水平下會(huì )相互競爭，影響相互的吸收。在制定改善人群營(yíng)養狀態(tài)的策略時(shí)，針對某一種微量營(yíng)養素，需要考慮它對其他微量營(yíng)養素吸收和利用的影響[11]。綜合考慮膳食中多種營(yíng)養素的生物利用率，有利于充分發(fā)揮營(yíng)養素的價(jià)值，避免因營(yíng)養素間的相互作用而造成浪費。
在制定人體鈣DRIs時(shí)，因此也要考慮高鈣攝入對其他礦物質(zhì)元素的影響，盡量選擇礦物質(zhì)吸收率較高時(shí)的鈣攝入量水平。鐵、鋅的吸收率除了受機體本身的營(yíng)養狀況影響之外，還與多種因素有關(guān)，其中最重要的是膳食中其他成分的作用[4]。目前關(guān)于鈣對鐵、鋅吸收率的影響一直存有爭議。人體內鈣含量最高，鋅含量與鐵相近，3種礦物質(zhì)可能通過(guò)相互作用抑制機體對他們的吸收[12]。動(dòng)物實(shí)驗發(fā)現，給正常生長(cháng)發(fā)育期的大鼠補充過(guò)量鈣劑，會(huì )降低大鼠血清中的鐵蛋白濃度，干擾鐵的吸收利用[13]。補鈣對美國學(xué)齡前兒童的鐵吸收沒(méi)有影響，但降低鋅的吸收[14]。長(cháng)期補鈣對12~14歲女孩鐵的營(yíng)養狀態(tài)沒(méi)有影響[15]。但也有研究發(fā)現，（13.5±1.5）歲女孩鈣攝入量增加，會(huì )輕度降低血清鐵的含量[16]。膳食鈣攝入量達到1500mg/d時(shí)，不影響少年女生對鋅的吸收用[17]。
本研究發(fā)現，雖然各補鈣組間礦物質(zhì)的表觀(guān)吸收率沒(méi)有顯著(zhù)性差異，但男生鈣攝入量為600~800mg/d時(shí)，鈣、鐵、鋅的表觀(guān)吸收率均處于比較高的水平，說(shuō)明攝入此水平的鈣能促進(jìn)鐵、鋅的吸收，而攝入更多的鈣可能不利于鐵、鋅的吸收。當鈣攝入量達到1000mg/d以上時(shí)，鈣吸收率僅為10%，鐵、鋅的吸收率也迅速下降，說(shuō)明少年男生的鈣需要量標準不宜太高，否則可能會(huì )影響鐵和鋅的吸收。鈣的攝入在一定范圍內可能不會(huì )影響少年女生鐵和鋅的吸收。
參考文獻
1. 王隴德. 中國居民營(yíng)養與健康狀況調查報告之一2002綜合報告[M]. 北京：人民衛生出版社，2005: 21-22.
2. 樸俊紅, 龐蓮萍, 劉忠厚, 等. 中國人口狀況及原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標準和發(fā)生率[J]. 中國骨質(zhì)疏松雜志, 2002, 8(1): 1-7.
3. FISCHER W C, KORDAS K, STOLTZFUS R J, et al. Interactive effects of iron and zinc on biochemical and functional outcomes in supplementation trials[J]. Am J Clin Nutr, 2005. 82(1): 5-12.
4. 葛可佑.中國營(yíng)養科學(xué)全書(shū)[M]. 北京：人民衛生出版社，2004：105-108.
5. 翟鳳英, 楊曉光, 葛可佑. 中國居民營(yíng)養與健康狀況調查報告之二[M]. 北京：人民衛生出版社, 2006：251-259.
6. 中國營(yíng)養學(xué)會(huì ). 中國居民膳食營(yíng)養素參考攝入量[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版, 2001：177-209.
7. 張?chǎng)? 郭冬梅, 崔唏, 等. 山東省農村兒童代表性膳食中鐵、鈣吸收率分析[J]. 中國公共衛生, 2006, 22(5): 555-556.
8. 崔唏, 孫晶, 藺新英, 等. 山東農村典型膳食兒童人體鋅吸收率研究[J]. 中國公共衛生, 2005, 21(7): 792-794.
9. LISBETH G P, KLAUS B, MIKAEL J, et al. Calcium from milk or calcium-fortified foods does not inhibit nonheme-iron absorption from a whole diet consumed over a 4-d period[J]. Am J Clin Nutr,2004, 80: 404 -413.
10. 周繼昌, 黃承鈺, 張慧敏, 等. 穩定性同位素評價(jià)藏族青年男子膳食鐵的吸收率[J]. 衛生研究, 2006, 35(1): 66-68.
11. SANDSTROM B. Micronutrient interactions: effects on absorption and bioavailability[J]. Br J Nutr, 2001, 85 (Suppl 2): 181-186.
12. 陳君石, 聞芝梅. 現代營(yíng)養學(xué)[M]. 北京：人民衛生出版社, 1998: 267-294.
13. 閻春生, 劉輝, 王志凡, 等. 不同鈣負荷劑量對大鼠生長(cháng)及鈣鐵鋅水平影響[J]. 中國公共衛生, 2005, 2l(l0):1176-1178.
14. MENDOZA C, PEERSON J M, BROWN K H, et al. Effect of a micronutrient fortificant mixture and 2 amounts of calcium on iron and zinc absorption from a processed food supplement[J]. Am J Clin Nutr, 2004, 79(2):244-250.
15. M?LGAARD C, K?STEL P, MICHAELSEN K F. Long-term calcium supplementation does not affect the iron status of 12-14-y-old girls[J]. Am J Clin Nutr, 2005, 82:98-102.
16. VIJVER LPLVD, KARDINAAL A F M, CHARZEWSKA, et al. Calcium intake is weakly but consistently negatively associated with iron status in girls and women in six European countries[J]. J Nutr, 1999, 129(5):963-971.
17 MCKENNA A A, ILICH J Z, ANDON M B, et al. Zinc balance in adolescent females consuming a low- or high-calcium diet[J]. Am J Clin Nutr, 1997, 65: 1460-1464.
作者簡(jiǎn)介：尹婧，女，博士
1通訊作者
論著(zhù)
同型半胱氨酸對人血管平滑肌細胞5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因啟動(dòng)子甲基化修飾及mRNA表達的影響
王麗珍 張敬各 王樹(shù)人[1]
四川大學(xué)華西基礎醫學(xué)與法醫學(xué)院病理生理學(xué)教研室，成都 610041
摘 要：目的 探討同型半胱氨酸（Hcy）對人血管平滑肌細胞（HVSMCs）5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因啟動(dòng)子甲基化修飾及其mRNA表達的影響。方法 正常人臍動(dòng)脈血管平滑肌細胞體外培養，在培養基中加入臨床高Hcy血癥相關(guān)濃度及極高濃度的Hcy (0、30、100、200、500和1000μmol/L)，并孵育72h，以MS-PCR分析MTHFR啟動(dòng)子區域甲基化狀態(tài)，采用RT-PCR測定 MTHFR mRNA的表達水平。結果 不同濃度Hcy處理人血管平滑肌細胞后，其MTHFR基因啟動(dòng)子區域出現去甲基化，甲基化水平明顯降低。RT-PCR結果顯示MTHFR mRNA表達增加。結論 Hcy可促進(jìn)人血管平滑肌細胞MTHFR啟動(dòng)子區域去甲基化，并使MTHFR mRNA表達增加。
關(guān)鍵詞 同型半胱氨酸 5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶 DNA甲基化
中圖分類(lèi)號：R54 Q55 文獻標識碼：A
Demethylation in the promoter region of MTHFR gene and its mRNA expression in cultured human vascular smooth muscle cells induced by homocysteine
WANG Lizhen, ZHANG Jingge, WANG Shuren
West China college of preclinic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Abstract:Objective To investigate the effect of homocysteine(Hcy) on the methylation modification of 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) gene promoter and its mRNA expression in cultured human vascular smooth muscle cells(HVSMCs). Methods HVSMCs from umbulical arteries were isolated and cultured in DMEM/F12 medium, which clinic-relevant and very high homocysteine concentrations (0,30,100,200,500,1000μmol/L) were added for 72h treatment. Methylation-specific polymerase chain reaction(MS-PCR) was performed to catalyze the methylation pattern of the MTHFR promoter region, semiquantitative RT-PCR was used to detect the MTHFR mRNA expression after Hcy treatment. Results The homocysteine induced demethylation in the promoter region of MTHFR gene at all concentrations of Hcy, the methylation pattern in MTHFR gene displayed significant hypomethylation and the MTHFR mRNA expression demonstrated obvious upregulation as well. Conclusion The homocysteine could induce demethylation in the promoter region of MTHFR gene in HVSMCs and upregulate the MTHFR mRNA expression.
Key words:homocysteine, 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase, DNA methylation
近年來(lái)表觀(guān)遺傳學(xué)(epigenetics)的飛速發(fā)展已逐漸揭示出環(huán)境因素對基因表達調控的許多重要機制，染色質(zhì)和DNA序列的乙酰化和甲基化修飾是近年來(lái)受到最廣泛關(guān)注、并被認為是基因表達的主要epigenetic調控方式。除了基因設定程序的自身調控外，營(yíng)養因素，如葉酸、維生素B6、維生素、B12的缺乏也常可導致高同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）血癥和基因組甲基化狀態(tài)的改變。一般認為，DNA甲基化使基因靜默(silence)，而去甲基化使基因活化。成年后基因組甲基化狀態(tài)的改變通常被認為具致病性[1,2]。
高同型半胱氨酸（Hcy）血癥被廣泛認為是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)的一個(gè)獨立危險因子，其致As的機制包括損傷血管內皮細胞、促進(jìn)平滑肌細胞增殖、導致氧化應激、激活炎癥過(guò)程等等[3]。近年來(lái)的研究顯示，高Hcy血癥亦可能干擾基因的甲基化修飾，進(jìn)而引起某些基因的表達異常而促進(jìn)As的發(fā)生發(fā)展[4]。
Hcy為非蛋白質(zhì)組成氨基酸，系各種轉甲基代謝（包括DNA的甲基化修飾）的甲硫氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。既然Hcy是甲硫氨酸循環(huán)的重要一環(huán)，其異常升高則很可能影響DNA的甲基化過(guò)程，并進(jìn)而影響某些基因的表達而促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。YING等報道，人主動(dòng)脈平滑肌細胞的雌激素受體-α基因啟動(dòng)子區的高甲基化促使其向增殖表型轉化，可能參與了As的發(fā)生發(fā)展[5]。LUND等報道，在apoE缺失的小鼠，其DNA甲基化的多態(tài)性變化早于任何As的組織學(xué)證據[6]。但迄今為止，有關(guān)這些甲基化改變在A(yíng)s發(fā)病機制中的作用仍存在諸多爭論[7,8]。
5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是催化Hcy向甲硫氨酸轉化的關(guān)鍵酶，近年來(lái)大量的MTHFR多態(tài)性分析顯示其某些點(diǎn)突變與高Hcy血癥相關(guān)，并可能促進(jìn)As的發(fā)生、發(fā)展[9]。但許多高Hcy血癥也可起因于葉酸、維生素B6、B12的攝入不足[10]，Hcy的異常升高是否會(huì )反過(guò)來(lái)對MTHFR基因的甲基化狀態(tài)產(chǎn)生致病性傷害？本研究希望通過(guò)以臨床相關(guān)的高Hcy濃度直至極高濃度的Hcy處理人血管平滑肌細胞（human vascular smooth muscle cells，HVSMCs），以探討高Hcy對MTHFR基因的甲基化修飾和基因表達會(huì )產(chǎn)生的影響。
1 材料和方法
1.1人血管平滑肌細胞培養
人血管平滑肌細胞取自正常臍動(dòng)脈，采用組織貼塊法獲得。簡(jiǎn)言之，取正常臍帶，迅即在無(wú)菌操作下取出臍動(dòng)脈，分離血管中膜,去除外膜及內皮，并剪成約1mm3左右的小塊，均勻貼附于25cm2卡式培養瓶中，加入含有20%胎牛血清(杭州四季青)的DMEM/F12培養液(Gibco)于37℃的CO2孵育箱內培養，約十天左右可見(jiàn)平滑肌細胞從組織塊周?chē)瘸觯囵B細胞生長(cháng)融合至75%~95%培養面用0.125%胰蛋白酶消化傳代增殖，選用3~7代細胞作為實(shí)驗用細胞。
1.2實(shí)驗分組
對照組：正常生長(cháng)的平滑肌細胞；Hcy(Sigma)處理組：不同濃度Hcy（0、30、100、200、500和1000μmol/L）作用細胞72h，每24h更換一次培養液，并添加新鮮配制的Hcy。
(30、100、200和500μmol/L為臨床高Hcy血癥相關(guān)濃度，同型半胱氨酸尿癥病人的Hcy血濃度可達500μmol/L，1000μmol/L為極高濃度的Hcy)。
1.3 MTHFR mRNA表達的檢測
1.3.1細胞總RNA提取 細胞懸液以1×105/ml接種于6孔培養板中，培養72h后胰酶消化，收集各組細胞，用TRIzol總RNA抽提試劑(TIANGEN公司)提取總RNA。
1.3.2逆轉錄合成cDNA 取RNA模板1μg（DOUPSON RT-PCR試劑盒）0ligo（dT）15 1μl，RNase-free H2O補齊至10μl，70℃放置5min，迅速置于冰上5min，順序加入M-MLV 5×Buffer 4μl，dNTPS（10mmol/L）1μl，RNase Inhibitor 0.5μl，M-MLV RT 1μl，RNase-free H2O 3.5μl，37℃反應1h，75℃孵育15分鐘終止反應，合成的cDNA用于PCR反應。
1.3.3 PCR擴增MTHFR基因 PCR反應體系為cDNA 1μl，10×Taq Buffer 5μl，dNTPs（10mmol/L）1μl，MTHFR上下游引物各0.5μl，內參照(β-actin)上下游引物(均由Invitrogen公司合成)各0.3μl，Taq酶1μl，補水至50μl，PCR反應條件為預變性95℃ 3min，變性95℃ 30s，退火63℃ 45s，延伸72℃1min，循環(huán)30輪后延伸10min。MTHFR引物序列正義5’-GTC TGC GGG AGC CGA TTT-3’，反義5’-CGG TTG AGG GTG TAG AAG TGG-3’，產(chǎn)物321bp。PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下照相，圖像分析處理系統進(jìn)行灰度掃描，以β-actin作為內參照比較正常對照組和Hcy組MTHFR灰度的比值，β-actin引物序列正義5’-CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG C-3’，反義5’-GTG ATC TCC TTC TGC ATC CTG T-3’，產(chǎn)物695 bp。
1.4 MTHFR基因啟動(dòng)子區甲基化改變的檢測
1.4.1 細胞基因組DNA提取及亞硫酸鈉處理 各組細胞培養72h，按DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）說(shuō)明抽提各組細胞基因組DNA，各取2μg溶于30μl 雙蒸水（ddH2O），加入新鮮配制的10mmol/L氫醌18μl及3mol/L 亞硫酸鈉(美國Sigma公司)312μl，pH值為5.0，50℃水浴處理16h，過(guò)柱純化，無(wú)水乙醇沉淀并重新溶解于15μl ddH2O。DNA經(jīng)亞硫酸鈉處理后，CpG二核苷酸對中未甲基化的胞嘧啶被轉化為胸腺嘧啶(C→T)，而甲基化的5’甲基胞嘧啶則不受亞硫酸鈉處理的影響，仍為5’甲基胞嘧啶，可以后續的甲基特異性-聚合酶鏈反應（MS-PCR）分析其甲基化程度的改變。
1.4.2 MTHFR啟動(dòng)子甲基化檢測：采用MS-PCR分析MTHFR啟動(dòng)子區域甲基化狀態(tài)，以上述處理DNA為模板，分別用兩對等位的MTHFR甲基化（MTHFR–M，對應于未受亞硫酸鈉處理影響的5’甲基胞嘧啶）和非甲基化（MTHFR-U，對應于已被亞硫酸鈉處理轉化的C→T）特異性引物（Invitrogen公司）擴增該基因啟動(dòng)子區。引物序列和擴增條件如下表。
表1 MSP引物序列及擴增條件
Table1 PCR primers used for MSP and amplification conditions
|
引物名稱(chēng)
|
正義引物 5’- 3’
|
反義引物5’- 3’
|
產(chǎn)物
(bp)
|
降落PCR溫度
(℃)
|
|
巢式PCR外引物
|
GTAGTAGTATTATTTGTAGTA
|
ACCATTAAAAATTACACTA
|
605
|
（63→43）×20循環(huán)(-1.0/循環(huán))→43×20循環(huán)
|
|
MTHFR-M
|
TTTTTAGTTAGGATTTGCGTTTTAC
|
GTTAAA AACCGTACCTTTATCGTC
|
144
|
（65→45）×20循環(huán)(-1.0/循環(huán))→45×20循環(huán)
|
|
MTHFR-U
|
TTTAGTTAGGATTTGTGTTTTATGT
|
CATTAAAAACCATACCTTTATCATC
|
143
|
（65→45）×20循環(huán)(-1.0/循環(huán))→45×20循環(huán)
|
1.5 統計學(xué)處理
數據采用x±s表示，應用SPSS12.0軟件采用單因素方差分析方法進(jìn)行統計學(xué)分析，P<0.05差異有顯著(zhù)性。
2 結果
2.1 Hcy對HVSMCs MTHFR mRNA表達的影響
圖1顯示，Hcy可明顯上調VSMCs MTHFR mRNA表達水平，其mRNA表達水平在100μmol/L Hcy時(shí)達到高峰（0.559±0.0467），直至極高濃度Hcy時(shí)仍刺激MTHFR mRNA呈高表達，與對照組相比差異有顯著(zhù)性（P<0.05，P<0.01）。
M：marker；1：Control (0μmol/L Hcy組)；2：30μmol/L Hcy組；3：100μmol/L Hcy組；4：200μmol/L Hcy組；5：500μmol/L Hcy組；6：1000μmol/L Hcy組
圖1 不同濃度Hcy刺激HVSMCs MTHFR mRNA RT-PCR擴增產(chǎn)物
Figure 1 RT-PCR products of MTHFR mRNA in HVSMCs induced by Hcy at different concentrations
2.2 MTHFR啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)分析
MS-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結果可見(jiàn)(圖2)，未經(jīng)Hcy處理的細胞 (對照組) MTHFR啟動(dòng)子區既有甲基化引物擴增出的特異PCR條帶，又有非甲基化引物擴增出的特異PCR條帶。經(jīng)Hcy處理的細胞MTHFR啟動(dòng)子區幾乎只有非甲基化特異PCR條帶，即Hcy誘導了明顯的MTHFR基因啟動(dòng)子區的去甲基化過(guò)程。
M：marker；1：Control (0μmol/L Hcy組)；2：100μmol/L Hcy組；3：500μmol/L Hcy組；4：1000μmol/L Hcy組；m：甲基化特異產(chǎn)物；u：非甲基化特異產(chǎn)物
圖2 MSP檢測不同濃度Hcy對HVSMCs MTHFR啟動(dòng)子區甲基化狀態(tài)的影響
Figure 2 MSP analysis of the MTHFR promotor methylation status in HVSMCs induced by Hcy at different concentrations
3 討論
Hcy為非蛋白質(zhì)組成氨基酸，系在轉甲基代謝的甲硫氨酸循環(huán)中生成，其在細胞內的代謝過(guò)程如下：SAM遞出甲基后生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH脫腺苷生成Hcy，Hcy可接受N5-甲基四氫葉酸提供的甲基生成甲硫氨酸，后者被活化重新生成SAM，稱(chēng)為甲硫氨酸循環(huán)。該循環(huán)中向Hcy供甲基的N5-甲基四氫葉酸須由N5,N10－亞甲基四氫葉酸經(jīng)N5,N10－亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）催化生成。MTHFR是維持甲硫氨酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，若該酶活性不足，則Hcy向甲硫氨酸的再循環(huán)受阻，SAM生成不足，轉甲基反應因供體缺乏而受阻，而Hcy在血液中聚集。Hcy亦可轉而經(jīng)胱硫醚合酶(CBS)催化，生成胱硫醚進(jìn)而分解。如圖3。
SAM：S-adenomethionine，SAH：S-adenohomocysteine，CBS：cystathionine synthase，MTHFR：5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，THF：methylenetetrahydrofolate
圖3 同型半胱氨酸代謝和甲硫氨酸循環(huán)示意圖
Figure 3 Diagram of the homocysteine metabolism and methionine cycle
已知高Hcy血癥是As發(fā)病過(guò)程中一獨立危險因素，ZENG和AU-YEUNG等報導，高Hcy可誘導MCP-1、IL-8的表達和NF-κB的激活等[11,12]，這些都被解釋為高Hcy血癥致As的可能機制。但高Hcy是否僅僅引起致病性的基因表達改變？且此種基因表達改變是通過(guò)何種途徑實(shí)現的？本實(shí)驗以Hcy作用于人臍動(dòng)脈平滑肌細胞，結果顯示，高Hcy引起MTHFR基因啟動(dòng)子區的去甲基化，及MTHFR mRNA的明顯高表達。由于去甲基化使基因活化，因此，MTHFR mRNA的高表達應系高Hcy引起的MTHFR基因的epigenetic修飾所致。MTHFR系催化Hcy向甲硫氨酸轉化的關(guān)鍵酶，MTHFR的高表達顯然有助于降低過(guò)高的Hcy，這無(wú)疑是一種代償機制，而非高Hcy的損傷效應。目前已有文獻報導，增加飲食半胱氨酸可使血漿Hcy濃度升高，同時(shí)也使肝分泌MTHFR活性增加[13]。
高Hcy血癥可能起因于某些基因的變異，如胱硫醚合酶或MTHFR的基因缺陷可導致顯著(zhù)的同型半胱氨酸尿癥和早發(fā)的As [14,15]。MTHFR基因多態(tài)性分析已經(jīng)揭示出該酶基因的某些點(diǎn)突變與高Hcy血癥可能有關(guān)，如FROSST等證實(shí)的MTHFR基因677C-T突變導致其氨基酸序列的222位丙-纈氨酸的替代，使MTHFR的熱穩定性下降，活性降低，Hcy升高[15]。由于Hcy系DNA轉甲基后的代謝產(chǎn)物，產(chǎn)物的過(guò)度堆積顯然會(huì )反饋抑制DNA的轉甲基反應，降低DNA的甲基化程度，從而導致基因表達的異常和疾病的發(fā)生。
目前已有文獻報導，在A(yíng)s病損部位，呈現整個(gè)基因組DNA甲基化水平降低和個(gè)別基因CpG島高甲基化，并認為這與As的發(fā)病有關(guān)[16]。YING等報導，人主動(dòng)脈平滑肌細胞的雌激素受體-α基因啟動(dòng)子區的高甲基化促使其向增殖表型轉化，平滑肌細胞增殖是As發(fā)病的重要環(huán)節，雌激素可抑制平滑肌細胞增殖，雌激素受體基因啟動(dòng)子區的高甲基化顯然抑制雌激素受體的表達，這被認為可能與As的發(fā)病有關(guān)[5]。但As的獨立危險因子-高Hcy是否誘導DNA甲基化修飾的改變？且其誘導的DNA甲基化改變是否皆導致致病性的后果？尚罕有報導。本實(shí)驗的結果顯示高Hcy可導致MTHFR基因啟動(dòng)子區去甲基化，及MTHFR mRNA的明顯高表達。本實(shí)驗室另一組研究則證實(shí)，高Hcy引致雌激素受體-α基因啟動(dòng)子區的高甲基化，及雌激素受體的低表達(資料待發(fā)表)，后者與YING等所發(fā)現的人主動(dòng)脈平滑肌細胞的雌激素受體-α基因啟動(dòng)子區的高甲基化相一致，而這可能與As病損中的平滑肌增殖有關(guān)，應屬致病性的epigenetic修飾。同樣的Hcy濃度，同樣的實(shí)驗模型，何以使某些基因去甲基化，而使另一些基因高甲基化？同時(shí)，是否高Hcy所導致的DNA甲基化改變皆系高Hcy的致病效應？目前尚無(wú)合理的結論和解釋?zhuān)撌聦?shí)已為許多實(shí)驗室的研究所證實(shí)[6,8]。顯然，高Hcy對DNA的epigenetic修飾具有多種模式。
而本研究結果清楚表明的認識是，高Hcy可通過(guò)引起DNA甲基化修飾的改變，而改變某些基因的表達；高Hcy對基因甲基化修飾的影響可以是損傷的、致病的，但亦可能是代償性反應。由于干預DNA甲基化修飾的治療策略已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域，因此，闡明在同一影響因素下，何以某些基因去甲基化，而另一些基因高甲基化？哪些DNA甲基化修飾的改變是致病的，哪些是代償性的？對于合理的制定干預策略無(wú)疑具有重要的理論和實(shí)踐意義。
參考文獻
1 ISSA J P. Epigenetic variation and human disease[J]. J Nutr, 2002, 132 (8 Suppl):2388-2392.
2 RICHARDSON B C. Role of DNA methylation in the regulation of cell function: autoimmunity, aging and cancer[J]. J Nutr,2002, 132 (8 Suppl):2401-2405.
3 Welch GN，Loscalzo J. Homocysteine and atherothrombosis[J]. N Engl J Med, 1998, 338(15): 1042-1050.
4 DONG C, YOON W, GOLDSCHMIDT-CLERMONT P J. DNA methylation and atherosclerosis[J]. J Nutr, 2002, 132(8 Suppl):2406-2409.
5 YING A K, HASSANAIN H H, ROOS C M, et al. Methylation of the estrogen receptor-α gene promoter is selectively increased in proliferating human aortic smooth muscle cells[J].Cardiovasc Res, 2000, 46(1):172-179.
6 LUND G, ANDERSSON L, LAURIA M, et al. DNA methylation polymorphisms precede any histological sign of atherosclerosis in mice lacking apolipoprotein E[J]. J Biol Chem, 2004, 279 (28):29147-29154.
7 UELAND P M, REFSUM H, BERESFORD S A , et al. The controversy over homocysteine and cardiovascular risk[J]. Am J Clin Nutr, 2000, 72(2):324-332.
8 JAMES S J, MELNYK S, POGRIBNA M, et al. Elevation in S-ademosylhomocysteine and DNA hypomethylation: potential epigenetic mechanism for homocysteine-related pathology[J]. J Nutr, 2002 ,132 (8 Suppl):2361-2366.
9 MOTTI C, GNASSO A, BERNARDINI S, et al. Common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Correlation with homocysteine and other risk factors for vascular disease[J]. Atherosclerosis,1998 ,139(2):377-383.
10 GEISEL J, SCHORR H, BODES M, et al. The vegetarian lifestyle and DNA methylation[J]. Clin Chem Lab Med,2005, 43(10):1164-1169.
11 ZENG X, DAI J, REMICK D G,et al. Homocysteine mediated expression and secretion of monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-8 in human monocytes[J]. Circ Res, 2003,93(4):311- 320.
12 AU-YEUNG K K, WOO C W,SUNG F L,et al. Hyperhomocysteinemia activates nuclear factor-κB in endothelial cells via oxidative stress[J]. Circ Res,2004,94(1):28-36.
13 SOUTHERN F, EIDT J, DROUILHET J, et al. Increasing levels of dietary homocystine with carotid endarterectomy produced proportionate increases in plasma homocysteine and intimal hyper- plasia[J]. Atherosclerosis , 2001 , 158(1): 129-138.
14 KRAUS J P, JANOSIK M, KOZICH V , et al. Cystathionine beta-synthase mutations in homo- cystinuria[J]. Hum Mutat,1999,13(5):362-375.
15 FROSST P, BLOM H J, MILOS R,et al. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase[J]. Nat Genet, 1995,10(1): 111- 113.
16 HILTUNEN M O,YLA-HERTTUALA S. DNA methylation, smooth muscle cells, and atherogenesis [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol , 2003,23(10):1750-1753.