達能營(yíng)養中心在全球
青年科學(xué)工作者論壇2007年第1期
《衛生研究》--2007年第一期
Hen 論著(zhù)
Cry1Ie基因在大腸桿菌中的表達及等同性鑒定
徐海濱 張曉霞 李芳 王國英[1] 劉允軍1
中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所，北京 100021
摘要：目的 以Cry1Ie基因表達蛋白為模式蛋白，建立外源基因表達蛋白的技術(shù)平臺。方法 利用大腸桿菌系統高效表達Cry1Ie蛋白，并采用SDS-PAGE技術(shù)分離純化，通過(guò)生物學(xué)活性和免疫反應性?xún)身椫笜藱z測了大腸桿菌表達蛋白與轉基因玉米中蛋白的等同性。結果 大腸桿菌表達系統可以產(chǎn)生大量的Cry1Ie蛋白，所獲得的蛋白與轉Cry1Ie玉米表達的Cry1Ie蛋白有相同的免疫反應性和生物活性。結論 大腸桿菌表達系統可以作為Cry1Ie外源基因蛋白表達技術(shù)平臺用于轉基因植物食用安全性的初步研究。
關(guān)鍵詞：轉基因玉米 Cry1Ie蛋白 大腸桿菌 實(shí)質(zhì)等同性 蛋白表達和純化
中圖分類(lèi)號：TS 201.6 Q786 TS 201.3 文獻標識碼：A
Expression and identification of Cry1Ie in Bacillus coli
XU Haibin, ZHANG Xiaoxia, LI Fang, WANG Guoying, et al.
Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China
Abstract：Objective In this study, Cry1Ie expressed protein in the transgenic Cry1Ie maize is used as a model protein to establish a technical platform for the safety assessment of other genetically modified plants. Methods Bacillus coli expression system was used to express Cry1Ie protein and then the expressed protein was purified by SDS-PAGE. The equivalence of Cry1Ie proteins expressed in Bacillus coli and in transgenic Cry1Ie maize was analyzed by their immunorecognition and bioactivity. Results Cry1Ie protein was highly expressed in Bacillus coli and could be segregated and purified by SDS-PAGE. Cry1Ie expressed protein in Bacillus coli is substantially equivalent to that of Maize Genetically Modified with Cry1Ie in tests of immunorecognition western blot and bioactivity in target pest. Conclusion The established technical platform of external Cry1Ie expressed protein can be applied to assess the food safety of genetically modified plants.
Key words: genetically modified maize, Cry1Ie, Bacillus coli expression, substantial equivalence, protein expression and purification
以重組DNA技術(shù)為代表的生物技術(shù)是21世紀最重要的高新技術(shù)之一。隨之轉基因作物商品化的發(fā)展，轉基因食品在給人們帶來(lái)巨大的經(jīng)濟與社會(huì )效益同時(shí)，其食用安全性問(wèn)題日益受到各國政府、學(xué)術(shù)界和消費者的關(guān)注。評價(jià)轉基因食品及食品成分是否與目前市售的傳統食品具有實(shí)質(zhì)等同性是食品安全性評價(jià)的一個(gè)重要方面。
Bt殺蟲(chóng)蛋白基因來(lái)源于蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis即Bt桿菌)，是天然存在于土壤中的格蘭氏陽(yáng)性菌[1]，在其芽孢形成過(guò)程中產(chǎn)生許多以結晶方式存在的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)具有殺蟲(chóng)活性， 通常也被稱(chēng)為Bt殺蟲(chóng)蛋白。Bt蛋白是引入轉基因植物的主要殺蟲(chóng)蛋白之一，Cry1類(lèi)蛋白主要對鱗翅目害蟲(chóng)具有特異性殺蟲(chóng)活性，Bt殺蟲(chóng)蛋白按氨基酸序列的同源性可分為45大類(lèi)313種[2]。目前已經(jīng)發(fā)現多種Cry1蛋白有Cry1A類(lèi)、Cry1B類(lèi)、Cry1C類(lèi)、Cry1D類(lèi)、Cry1I類(lèi)等。Cry1Ie抗蟲(chóng)基因屬于BT殺蟲(chóng)蛋白家族，是我國科學(xué)家首次分離克隆出來(lái)的一種新的Cry基因。以此蛋白作為模式蛋白，選擇適合的高效表達目標基因編碼蛋白的表達系統，獲得目標蛋白，并對此蛋白進(jìn)行等同性分析，為開(kāi)展毒性評價(jià)，建立外源基因表達蛋白的評價(jià)提供技術(shù)平臺。
大腸桿菌表達系統是基因表達技術(shù)中發(fā)展最早、目前應用最廣泛的經(jīng)典表達系統[3]，此系統具有遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、表達產(chǎn)物容易純化、穩定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，本研究利用這一重要工具進(jìn)行轉Cry1Ie蛋白的表達及等同性鑒定。
1 材料與方法
1.1 菌種與質(zhì)粒
Cry1Ie基因的原始序列為GenBank中的序列AF211190。所用大腸桿菌菌株為DH5α和BL21菌購自道普公司，原核表達載體pET28b和PUC19Ie由中國農業(yè)大學(xué)農業(yè)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室劉允軍博士提供。
1.2主要實(shí)驗儀器和試劑
DNP－9162生化培養箱、BECKMAN臺式冷凍離心機、PCR擴增儀(GeneAmp PCR System 9700)、Bio-brand電泳槽、HITACHI分光光度計、STUART系列磁力攪拌器、Bio-Rad公司Mini Trans-blot Electrophoretic Transfer Cell電轉儀、MK-3酶聯(lián)檢測儀。限制性?xún)惹忻窷deI、SalI、T4 DNA連接酶購自promega公司。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、低分子量Marker、卡那霉素（Kan）、小牛血清白蛋白（BSA）、溶菌酶、酶標板(Coster)、透析袋等購自Sigma公司，50%Ni-NTA slurry購自QIAGEN，其它常用試劑和藥品購自華美、天為時(shí)代、道普等國內公司，DNA快速純化/回收試劑盒購自鼎國公司。
1.3含有轉化載體的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞構建和大腸桿菌BL21細胞的轉化
DH5α感受態(tài)細胞中加入20μl連接產(chǎn)物，混勻內容物，在冰中放置30min。將管放到預加溫到42℃的循環(huán)水浴中90s，迅速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1~2min，加LB培養基200μl，置于37℃搖床振搖培養，溫育45min使細胞復蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標記基因，將100~300μl已轉化的感受態(tài)細胞涂布到含相應抗生素的LB固體培養基上，于37℃培養12~16h，用鑒定好的原核表達載體轉化大腸桿菌BL21細胞，已備篩選。
1.4 Cry1Ie表達蛋白的可溶性分析和優(yōu)化條件篩選
收集已誘導的細胞，棄除上清液，沉淀加入等體積的2x上樣緩沖液，充分懸浮菌體，沸水中煮沸變性5min，冰浴2min。12000r/min，4℃下離心1min，灌制12%的分離膠，灌膠完畢后，插入梳子,靜置40min。待膠凝固后，裝配好膠槽，加入電極緩沖液，取20ml處理好的樣品上樣、跑膠，取出凝膠于染色液中染色1h，取出凝膠于脫色液中脫色2~3次,每次15min，用于蛋白的測定。
于已棄除上清液的沉淀中加入1/10體積的TE重懸細胞沉淀，加入10mg/ml的溶菌酶（用新鮮的TE緩沖液配制）至終濃度為100mg/ml。然后加入1/10體積的Triton-100，30℃培養15min，將離心管放入冰水浴中，超聲波處理剪切DNA，12000r/min，4℃下離心15min。取上清液和沉淀物分別進(jìn)行電泳。上清液含有可溶性蛋白，可以加入等體積的2×SDS上樣緩沖液后，煮沸5min，12000r/min，室溫離心5min，取30ml上清液進(jìn)行電泳分析；沉淀含有包涵體，可使用1×SDS上樣緩沖液重懸后，煮沸5min，12000r/min，室溫離心5min，取30ml上清液進(jìn)行電泳分析。
配制不同濃度的IPTG和IPTG誘導不同時(shí)間，分別通過(guò)蛋白測定和電泳分析篩選Cry1Ie蛋白表達最佳優(yōu)化條件。
1.5 Cry1Ie表達蛋白的純化（切膠回收法 ）和蛋白含量的測定
酶切片段及PCR產(chǎn)物的電泳回收采用DNA快速純化/回收試劑盒（鼎國公司產(chǎn)品）進(jìn)行純化和回收，凝膠回收法中目的蛋白的測定采用Werstern bolt方法，菌液蛋白含量的測定采用考馬斯亮蘭G250法。
1.6 轉Cry1Ie基因玉米葉片目的蛋白的提取
轉Cry1Ie基因玉米由中國農業(yè)大學(xué)王國英教授惠贈，葉片中目的蛋白的提取方法由中國農業(yè)大學(xué)農業(yè)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室劉永軍博士提供。將0.5g轉Cry1Ie基因玉米葉片用鑷子放入2ml離心管中，加入液氮充分研磨，待液氮揮發(fā)完后，加入1ml目的蛋白提取buffer，猛烈震蕩10min，10000r/min，4℃離心10min，取20μl上清，加入5μl 5×SDS buffer，于100℃加熱5min，立即置于冰上冷卻至室溫，12000r/min，4℃離心10min；取上清，-20℃保存備用。
1.7 Cry1Ie表達蛋白的等同性鑒定
1.7. 1 亞洲玉米螟的殺蟲(chóng)活性測定 稱(chēng)取5g人工飼料置于一滅菌培養皿中，分別加入1ml轉Cry1Ie基因玉米葉片目的蛋白或大腸桿菌表達Cry1Ie蛋白溶液，以空載體作為陰性對照，將提純蛋白質(zhì)的Buffer作為空白對照。充分混勻，分裝于經(jīng)消毒（5%福爾馬林浸泡）的24孔細胞培養板中。用毛筆輕輕接入玉米螟除孵幼蟲(chóng)，每孔一頭，每處理重復3次，放置25℃光照培養箱中，培養7天調查死、活蟲(chóng)數，及蟲(chóng)玉米螟的平均蟲(chóng)重[4]。
1.7. 2免疫反應活性測定 轉Cry1Ie基因玉米葉片目的蛋白或大腸桿菌表達Cry1Ie蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western 印跡實(shí)驗，分別測定并比較轉Cry1Ie基因玉米葉片目的蛋白或大腸桿菌表達Cry1Ie蛋白免疫反應活性，方法參見(jiàn)《 Moleculer Cloning》[5]。
2 結果
2.1含有轉化載體的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞構建和大腸桿菌BL21細胞的轉化
用NdeI和SalI酶切載體pET28b，回收5.3kb片段。用NdeI和SalI酶切載體pUC19Ie，回收2.2kb片段，進(jìn)行連接反應。構建所得原核表達質(zhì)粒命名為pETIe，用不同酶進(jìn)行酶切鑒定，表明載體構建正確（圖1）
M：1 kb DNA ladder Marker；1：NdeI 酶切；2: SalI 酶切；3：NdeI、SalI 酶切
圖1 質(zhì)粒pETIe的酶切鑒定
2.2 Cry1Ie表達蛋白的可溶性分析和優(yōu)化條件篩選
將500ml菌體分為10管，每管50ml，1~9管加入IPTG終濃度分別為0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0mmol/L，第10管加IPTG終濃度為0.5mmol/L，分別于誘導1、2、3、4、6、8、10、12h取1ml菌液。菌體收集后經(jīng)超聲破碎后，棄去上清，菌體沉淀有大量的目的蛋白。通過(guò)SDS-PAGE電泳分析IPTG誘導不同條件與誘導Cry1Ie蛋白表達含量的關(guān)系，發(fā)現在IPTG 0.3mmol/L濃度（圖2泳道7）、IPTG誘導4小時(shí)（圖3泳道5）時(shí)，Cry1Ie蛋白表達量最高，是高效表達的最佳優(yōu)化條件。
1：未誘導的BL21/pETIe 菌液，2~10：IPTG誘導濃度分別為0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L
圖2 不同IPTG誘導濃度序列
1：未誘導的BL21/pETIe 菌液，2~10. IPTG誘導時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6、8、10、12h
圖3 不同IPTG誘導時(shí)間序列
2.3 Cry1Ie表達蛋白的純化和蛋白含量的測定
用切膠回收法純化Cry1Ie表達蛋白，共得到50ml純化Cry1Ie蛋白，取20μl進(jìn)行SDS-PAGE，通過(guò)與BSA標準樣品比較，Cry1Ie蛋白表達的電泳條帶大小與8μg的BSA電泳條帶類(lèi)似，推測Cry1Ie蛋白含量為400μg/ml，見(jiàn)圖4。用考馬斯亮蘭G250，測定菌液中的Cry1Ie蛋白含量為420μg/ml，兩種方法結果基本一致，提示蛋白質(zhì)純化與定量效果較好。
1：Marker；2、3：ry1Ie蛋白；4~9：1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、8μg；對照：BSA
圖4 Cry1Ie表達蛋白的純化和蛋白定量
|
97Kd
66Kd
43Kd
31Kd
|
2.4.1 亞洲玉米螟的殺蟲(chóng)活性測定 以0.5×10-6、5.0×10-6、250.0×10-6mg/kg的純化Cry1Ie表達蛋白，載體菌液和緩沖溶液喂飼亞洲玉米螟，實(shí)驗重復3次，觀(guān)察其對殺蟲(chóng)率和平均蟲(chóng)重的影響。結果可見(jiàn)表，純化Cry1Ie蛋白對玉米螟的生長(cháng)抑制明顯，用寇氏法算得Cry1Ie蛋白的LC50=2.1×10-5mg/kg，LC95%可信限1.5×10-5~2.8×10-5mg/kg，殺蟲(chóng)活性高，此結果與同期中國農業(yè)大學(xué)王國英教授實(shí)驗室進(jìn)行的轉Cry1Ie玉米葉片的玉米螟蟲(chóng)試實(shí)驗結果有良好的一致性，提示純化Cry1Ie蛋白與轉Cry1Ie玉米表達的抗蟲(chóng)蛋白具有相似性的生物學(xué)活性。
附表 純化Cry1Ie表達蛋白對玉米螟蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性的影響
|
受試物
（×10-6，mg/kg） |
重復（次） |
昆蟲(chóng)數 |
平均蟲(chóng)重
（mg） |
平均死亡率
（%） | |
|
接蟲(chóng)數 |
活蟲(chóng)數 | ||||
|
緩沖溶液 |
3 |
144 |
131 |
0.27±0.03 |
9.0 |
|
體菌液 |
3 |
150 |
135 |
0.36±0.09 |
10.0 |
|
0.5 |
3 |
144 |
106 |
0.27±0.03(1) |
26.2(1) |
|
5.0 |
3 |
144 |
121 |
0.30±0.05(1) |
16.0** |
|
250.0 |
3 |
144 |
38 |
0.13±0.10(1) |
18.7(1) |
注：（1）緩沖溶液和載體菌液比較P<0.01
2.4.2免疫反應活性測定 由圖5和圖6可見(jiàn)，轉Cry1Ie玉米葉片中提取的Cry1Ie蛋白（泳道3）和大腸桿菌純化的Cry1Ie蛋白（泳道4）進(jìn)行Western blot分析，兩種受試物在66kDa到97kDa區域同一位置出現明顯的電泳條帶，說(shuō)明二者具有相同的免疫反應性。
M：低分子蛋白Marker；1：未誘導的BL21/pETIe 菌液；2：誘導的BL21/pETIe菌液；3：玉米葉中提取的濃縮Cry1Ie蛋白；4：從大腸桿菌純化的Cry1Ie蛋白；5：誘導的BL21/pETIe包涵體
圖5 免疫反應活性SDS-PAGE結果
圖6 免疫反應活性Western blot結果
3 討論
實(shí)質(zhì)等同性原則注重于轉基因植物與傳統對比物差異的評價(jià)，轉基因植物外源基因表達蛋白的安全性評價(jià)是現階段轉基因植物商品化的主要技術(shù)問(wèn)題之一。目前的分離技術(shù)，尚不能從轉基因植物中分離純化出足夠用于安全性評價(jià)的表達蛋白質(zhì)產(chǎn)物，因此，可以用外源表達系統產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)。凡是以微生物表達的蛋白代替轉基因植物中目的蛋白，需要符合以下的等同性驗證標準[6]：①兩者在二維凝膠電泳中表現一致； ②具有相同的結合單克隆、多克隆抗體的免疫反應性；③具有相同的翻譯后修飾（如糖基化）；④具有相似的氨基酸序列（N末端10~15個(gè)氨基酸序列至少3個(gè)短的內部蛋白序列）；⑤具有相似的生物學(xué)活性。
本研究依據實(shí)際情況，選擇了最具有代表性的生物學(xué)活性和免疫反應性?xún)身椫笜恕４竽c桿菌表達的蛋白與植物蛋白在SDS-PAGE凝膠上大體處于同一位置，分子量相近，在Western blot分析中，兩種受試物在66kDa到97kDa區域同一位置出現明顯的電泳條帶，顯示具有相同的免疫反應性；大腸桿菌表達的Cry1Ie蛋白殺蟲(chóng)活性較強，Cry1Ie 蛋白LD50=2.1×10-5 mg/kg，LC95%可信限1.5×10-5~2.8×10-5mg/kg，與宋福平的實(shí)驗結果（LC50=1.62×10-5，LC95%可信限5.35×10-6~3.9×10-5mg/kg）大體一致[7]；純化Cry1Ie蛋白對玉米螟的生長(cháng)抑制明顯，與轉Cry1Ie玉米葉片所進(jìn)行玉米螟蟲(chóng)試結果有良好的一致性，表明純化Cry1Ie蛋白與轉Cry1Ie玉米表達的抗蟲(chóng)蛋白在生物活性上具有相似性。就目的蛋白的關(guān)鍵特性——生物活性和免疫反應性而言，實(shí)驗結果提示大腸桿菌表達系統產(chǎn)生的目的蛋白與轉基因植物目的蛋白基本是等同的，可以用于后續的食用安全性評價(jià)。切膠回收法回收蛋白純度高，但對于大腸桿菌里高效表達的外源蛋白而言其置備效率偏低，蛋白生產(chǎn)量可以滿(mǎn)足用量較少的體外試驗和蛋白的穩定性實(shí)驗，如果進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗則受到產(chǎn)量的限制，需要摸索更高效率的純化方法。
4 參考文獻
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7 宋福平, 張杰, 韓嵐嵐,等. 對鱗翅目害蟲(chóng)有活性的crylC基因的克隆和表達[J]. 植物保護學(xué)報,2003，30（2）：161-165.
作者簡(jiǎn)介：徐海濱，男，博士，研究員，博士生導師
1 中國農業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心
調查研究
三種宣教干預方式對小學(xué)生營(yíng)養知識、態(tài)度、行為的影響
王燦楠 趙華碩[1] 劉沛 居培1 賀珍1 叢寧1
東南大學(xué)公共衛生學(xué)院營(yíng)養與食品科學(xué)系，南京，210009
摘要：目的 探索不同營(yíng)養宣教方式對小學(xué)生營(yíng)養知識、態(tài)度、行為（K-A-P）的影響。方法 采取整群隨機抽樣的方法，對徐州市四所小學(xué)3~5年級的1477名小學(xué)生和他們的家長(cháng)，采用舉辦專(zhuān)題講座，發(fā)放宣傳材料，出營(yíng)養知識宣傳板報，舉辦家長(cháng)營(yíng)養知識學(xué)習班等方法，進(jìn)行單獨學(xué)生干預、單獨家長(cháng)干預、學(xué)生及家長(cháng)聯(lián)合干預的營(yíng)養知識宣傳教育，比較接受不同宣教方式的小學(xué)生營(yíng)養知識、態(tài)度、行為等方面的變化。結果 經(jīng)過(guò)三種方式的營(yíng)養宣教后，雖然小學(xué)生的營(yíng)養知識水平及膳食行為均有不同程度提高，但以對學(xué)生及家長(cháng)聯(lián)合干預的效果最好，其次是對學(xué)生的干預。結論 在改進(jìn)小學(xué)生營(yíng)養知識、態(tài)度、行為的過(guò)程中，學(xué)校扮演了一個(gè)比家長(cháng)更為重要的角色。
關(guān)鍵詞：營(yíng)養 知識-態(tài)度-行為 小學(xué)生 家長(cháng)
中圖分類(lèi)號：R153.2 文獻標識碼：A
Effect of three ways of nutritional education on knowledge, attitude and practice with nutrition in pupils
WANG Cannan, ZHAO Huashuo, LIUu Pei, JU Pei, et al.
School of Public Health, the Southeast University, Nanjing 210009, China
Abstract Objective To explore the effects of different nutritional education ways on knowledge, attitude and practice with nutrition in pupils. Methods According to cluster randomization sampling methods, application three ways of nutritional education, nutritional education for pupils, nutritional education for pupils’ parents and nutritional education for both pupils and their parents, to 1477 pupils from three, four and five grades in primary school in Xuzhou city. Results Although each of three ways can improve the level of nutrition knowledge and diet behavior, the way of nutritional education for both pupils and their parents gets the best effect and the following is the way of nutritional education for pupils. Conclusion Primary schools play a more important role than pupils’ parents for improving pupils’ knowledge, attitude and practice with nutrition.
Key words: nutrition, knowledge-attitude-practice, pupil and parent
小學(xué)生正處于生長(cháng)發(fā)育時(shí)期，也是各種飲食行為和習慣形成的關(guān)鍵時(shí)期。采取有效的營(yíng)養教育方式，提高兒童青少年的營(yíng)養知識水平，幫助他們建立良好的飲食習慣，對于提高小學(xué)生當前及將來(lái)的健康水平具有重要意義。雖然，有關(guān)營(yíng)養知識-態(tài)度-行為（K-A-P）的調查已有一些報道[1~6]，但對采取學(xué)生干預、家長(cháng)干預、學(xué)生及家長(cháng)聯(lián)合干預三種不同方式進(jìn)行縱向隨訪(fǎng)研究的報道不多。根據“無(wú)論勸阻和鼓勵哪種行為，都必須把力量集中到習慣形成的最早場(chǎng)合”的健康教育學(xué)原理[7]，本研究采取學(xué)校教育和家庭教育相結合的方法開(kāi)展營(yíng)養宣教活動(dòng)，通過(guò)比較不同宣教方式的效果，既分析學(xué)校、家庭的獨立作用，又分析學(xué)校、家庭的聯(lián)合作用，從學(xué)校和家庭兩個(gè)方面入手，以期幫助小學(xué)生從小建立良好的飲食習慣。為此，我們按整群抽樣方法在徐州市隨機選取4所小學(xué)校對3~5年級1477名學(xué)生和他們的家長(cháng)進(jìn)行了為期一個(gè)學(xué)期的營(yíng)養宣教，并按流行病學(xué)前瞻性研究方法隨訪(fǎng)其宣教前、后營(yíng)養知識-態(tài)度-行為的變化情況，現將結果報告如下。
1方法
1.1調查對象及分組
以整群抽樣方法從徐州市隨機抽取4所小學(xué)3~5年級的33個(gè)班級共1477名學(xué)生作為調查對象。將四所學(xué)校隨機分為：對照組（不干預），學(xué)生干預組，家長(cháng)干預組，學(xué)生、家長(cháng)聯(lián)合干預組。
1.2 宣教內容及干預措施
根據小學(xué)生膳食特點(diǎn)及存在問(wèn)題，圍繞中國居民膳食指南、膳食寶塔、膳食補鈣、及早餐進(jìn)食情況等設計營(yíng)養知識、營(yíng)養態(tài)度、膳食行為三個(gè)方面的問(wèn)題共43道。預調查提示，學(xué)生及家長(cháng)可在5~10分鐘內完成答卷。在完成基線(xiàn)調查后，立即進(jìn)行隨機分組，然后，進(jìn)行為期一個(gè)學(xué)期的營(yíng)養宣教活動(dòng)。干預措施包括：由營(yíng)養專(zhuān)家舉辦營(yíng)養專(zhuān)題講座，發(fā)放營(yíng)養知識宣傳材料，出營(yíng)養知識宣傳板報，舉辦家長(cháng)營(yíng)養知識學(xué)習班等。宣教活動(dòng)結束，對學(xué)生和家長(cháng)進(jìn)行干預后的隨訪(fǎng)調查。
1.3 KAP評分
KAP調查問(wèn)卷由課題組根據研究目的、調查對象特點(diǎn)等反復討論，并經(jīng)預調查修改完善后確定。知識、態(tài)度、行為三方面的滿(mǎn)分各為100分，根據各部分題量多少賦予每題一定分值，再根據答題者的選擇計分并累加各題的分值作為最終得分，項目中的缺失值不參與計
分及統計分析【8】。
1.4統計分析
采用EpiData3.1軟件建立數據庫并進(jìn)行雙人雙機數據錄入，按實(shí)際數據的可能取值范圍，編寫(xiě)Check文件對數據進(jìn)行邏輯核對。采用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析和秩和檢驗。
2 結果
2.1基本情況
此次共獲得合格學(xué)生問(wèn)卷1477份，家長(cháng)問(wèn)卷1470份。學(xué)生中男生798人，女生679人，性別比為1.18:1。其中，谷山小學(xué)（對照學(xué)校）398人，臥牛小學(xué)（家長(cháng)宣教）366人，拾屯小學(xué)（學(xué)生宣教）322人，蘇山小學(xué)（家長(cháng)、學(xué)生均宣教）391人。
2.2學(xué)生營(yíng)養知識-態(tài)度-行為（K-A-P）得分
有關(guān)營(yíng)養知識的得分情況見(jiàn)表1。從表1可知，接受營(yíng)養宣教的3所小學(xué)的營(yíng)養知識得分在宣教后均有提高，宣教前后的得分差別具有統計學(xué)意義（P<0.01）；3所小學(xué)宣教前后的差值與對照學(xué)校比較差異有極顯著(zhù)性（P<0.01）。
表1 學(xué)生的營(yíng)養知識得分
Table 1 Score of pupils’ nutrition knowledge（x±s）
|
組別 |
人數 |
宣教前 |
宣教后 |
差值 |
|
對照學(xué)校 |
325 |
59.92±11.65 |
60.42±11.90 |
0.49±13.52 |
|
家長(cháng)宣教 |
300 |
56.73±8.82 |
62.05±10.09(1) |
5.32±11.55(2) |
|
學(xué)生宣教 |
264 |
55.09±10.39 |
64.34±12.75(1) |
9.24±14.03(2) |
|
家長(cháng)學(xué)生均宣教 |
309 |
58.62±10.60 |
67.15±11.70(1) |
8.53±12.77(2) |
注： (1)與宣教前比較P<0.01，(2)與對照組比較P<0.01
學(xué)生營(yíng)養態(tài)度得分見(jiàn)表2。從表2可知，各學(xué)校小學(xué)生營(yíng)養態(tài)度得分在宣教前后基本一致。只有學(xué)生和家長(cháng)均接受宣教的學(xué)校，宣教后學(xué)生的態(tài)度得分比宣教前提高（P<0.01），其提高的分值與對照組相比也有統計學(xué)意義（P<0.01）。其他三所學(xué)校宣教前后差值比較差異無(wú)顯著(zhù)性（P>0.05）。
表2 學(xué)生營(yíng)養態(tài)度得分
Table 2 Score of pupils’ nutrition attitude（x±s）
|
組別 |
人數 |
宣教前 |
宣教后 |
差值 |
|
對照學(xué)校 |
355 |
85.46±17.55 |
83.37±20.31 |
-2.09±20.48 |
|
家長(cháng)宣教 |
335 |
81.85±18.25 |
79.80±17.67 |
-2.05±20.24 |
|
學(xué)生宣教 |
295 |
78.31±19.89 |
77.79±19.12 |
-0.52±22.85 |
|
家長(cháng)學(xué)生均宣教 |
359 |
81.11±20.08 |
85.12±16.35(1) |
4.01±20.39(2) |
注： (1)與宣教前比較P<0.01，(2)與對照組比較P<0.01
學(xué)生飲食行為得分見(jiàn)表3。從表3可知，單獨對小學(xué)生進(jìn)行營(yíng)養宣教及對學(xué)生、家長(cháng)均宣教的兩所小學(xué)的營(yíng)養行為得分在宣教后得到提高（P<0.01），所提高的分值與對照學(xué)校比較也具有統計學(xué)意義（P<0.05）。而對照學(xué)校及對家長(cháng)宣教學(xué)校的飲食行為得分在宣教前后差異無(wú)顯著(zhù)性（P>0.05）。
表3 學(xué)生飲食行為得分
Table 3 Score of pupils’ nutrition behavior（x±s）
|
組別 |
人數 |
宣教前 |
宣教后 |
差值 |
|
對照學(xué)校 |
259 |
57.73±14.46 |
57.60±14.09 |
0.13±14.82 |
|
家長(cháng)宣教 |
283 |
60.16±16.49 |
59.74±12.77 |
-0.41±16.37 |
|
學(xué)生宣教 |
252 |
59.06±15.99 |
62.32±13.96 (1) |
3.25±15.93 (2) |
|
家長(cháng)學(xué)生均宣教 |
297 |
65.17±14.64 |
68.86±12.61 (1) |
3.69±15.79 (2) |
注： (1)與宣教前比較P<0.01，(2)與對照組比較P<0.01
2.3 學(xué)生食用早餐情況
宣教前后學(xué)生食用早餐情況見(jiàn)表4。從表4可知，學(xué)生宣教組，家長(cháng)和學(xué)生均宣教組在宣教后每天吃早餐的比例比宣教前提高了1~3個(gè)百分點(diǎn)，但差異無(wú)統計學(xué)意義（P>0.05）。
表4 宣教前后學(xué)生食用早餐情況比較
Table 4 Comparison of pupils’ breakfast between before and after of nutrition education %
|
組別 |
宣教前 |
宣教后 | ||
|
每天吃 |
不是每天吃 |
每天吃 |
不是每天吃 | |
|
對照學(xué)校 |
89.3 |
10.74 |
89.9 |
10.13 |
|
家長(cháng)宣教 |
86.6 |
13.39 |
90.7 |
9.32 |
|
學(xué)生宣教 |
89.4 |
10.62 |
92.8 |
7.21 |
|
家長(cháng)學(xué)生均宣教 |
93.5 |
6.53 |
94.9 |
5.08 |
2.4 學(xué)生食用豆制品情況
宣教前后學(xué)生食用豆制品情況見(jiàn)表5。由表5可看出，各學(xué)校學(xué)生在營(yíng)養宣教前食用豆制品的情況相似（P>0.10）；營(yíng)養宣教后，各學(xué)校學(xué)生食用豆制品的比例發(fā)生改變（P<0.001）。進(jìn)一步分析發(fā)現，家長(cháng)宣教學(xué)校與對照學(xué)校比較，差別無(wú)統計學(xué)意義；學(xué)生宣教及學(xué)生、家長(cháng)均宣教學(xué)校與對照學(xué)校間的差異有極顯著(zhù)性（P<0.01），且這兩所學(xué)校宣教前后的差異也有極顯著(zhù)性（P<0.01）。
表5 宣教前后學(xué)生食用豆制品情況比較
Table 5 Comparison of pupils’ intake of bean between before and after of nutrition education %
|
組別 |
宣教前 |
宣教后 | ||||||
|
天天 |
經(jīng)常 |
偶爾 |
不吃 |
天天 |
經(jīng)常 |
偶爾 |
不吃 | |
|
對照學(xué)校 |
15.1 |
50.4 |
19.9 |
14.6 |
11.0 |
45.4 |
22.6 |
21.0 |
|
家長(cháng)宣教 |
15.9 |
52.2 |
15.7 |
16.2 |
15.6 |
49.3 |
20.1 |
15.0 |
|
學(xué)生宣教 |
14.5 |
43.5 |
21.8 |
20.2 |
22.0 |
51.8 |
16.1 |
10.2 |
|
家長(cháng)學(xué)生均宣教 |
19.2 |
49.1 |
16.5 |
15.2 |
41.6 |
45.9 |
8.0 |
4.5 |
3討論
3.1小學(xué)生營(yíng)養K-A-P現狀分析
本次調查結果顯示，小學(xué)生營(yíng)養知識在宣教前平均只有57.6分，提示小學(xué)生的營(yíng)養知識水平有待提高。但小學(xué)生關(guān)注自身健康，樂(lè )于接受營(yíng)養知識的宣傳教育，其態(tài)度得分平均達81.7分，積極的態(tài)度為進(jìn)行營(yíng)養宣傳教育奠定了良好基礎。由于營(yíng)養知識欠缺，直接影響了他們的飲食行為，表現為小學(xué)生膳食行為得分不高，平均只有60.5分。這些結果均說(shuō)明了對小學(xué)生開(kāi)展營(yíng)養宣教的必要性。
3.2 不同宣教方法對小學(xué)生營(yíng)養的K-A-P影響
在本次研究中，對小學(xué)生直接進(jìn)行營(yíng)養宣傳教育的兩所學(xué)校的學(xué)生，宣教后的飲食行為得分均比宣教前提高；所提高的分值與對照學(xué)校比較也具有統計學(xué)意義。而僅對家長(cháng)進(jìn)行宣教的學(xué)生以及對照學(xué)校的學(xué)生，飲食行為得分在宣教前后未見(jiàn)差別。這一現象在營(yíng)養豐富、價(jià)格低廉的豆制品食用變化上表現的更為明顯。小學(xué)生正處于生長(cháng)發(fā)育階段，對營(yíng)養知識的求知欲強，飲食行為的可塑性大，及早進(jìn)行教育，有利于形成良好的飲食習慣，對其一生的健康意義重大[7]。本次研究提示，在這一過(guò)程中，學(xué)校可能扮演了一個(gè)比家長(cháng)更為重要的角色。
在本次營(yíng)養宣教干預中，小學(xué)生在早餐行為上的改變不明顯。這可能與原來(lái)學(xué)生中每天吃早餐的比例比較高，加之宣教時(shí)間較短，宣教內容較廣，學(xué)生改變已形成的飲食習慣需要一定的時(shí)間等有關(guān)。由此也使我們認識到，要培養學(xué)生良好的飲食習慣和健康行為需要進(jìn)行有效、長(cháng)期的不懈努力，才能達到最終目的。
3.3 組間可比性及偏倚控制
為保證組間的可比性，我們主要采取了兩項措施。一是在試驗分組時(shí)采取了兩次隨機化，即隨機抽取試驗單位和將試驗單位隨機分配入4個(gè)組。因影響營(yíng)養宣教效果的因素較多，故嚴格遵循隨機原則是保證組間可比性的關(guān)鍵環(huán)節。二是為減少各學(xué)校基線(xiàn)水平對結果的影響，在評價(jià)干預效果時(shí)，我們用各組干預后結果減去其相應基線(xiàn)結果，然后比較組間差值的方法，從而增加了組間的可比性。
在一個(gè)較大規模的人群隨訪(fǎng)研究中，極易出現導致研究結果系統偏離真實(shí)情況的現象[9]。為控制“試驗污染”（trial contamination），在干預過(guò)程中，我們盡可能使對照組不受到本次營(yíng)養宣教活動(dòng)的影響，并規定在基線(xiàn)調查后，立即進(jìn)行隨機分組，以最大限度消除“調查偏倚”[9]。為減少失訪(fǎng)偏倚，我們積極爭取學(xué)校主管部門(mén)和校方的配合，使得本次調查沒(méi)有發(fā)生群（學(xué)校、班級）水平上的失訪(fǎng)，并盡可能減少了個(gè)體失訪(fǎng)。雖然上述措施對控制偏倚具有積極作用，但由于小學(xué)生對調查問(wèn)卷在理解上和認真程度上的差異，在一些項目的填寫(xiě)上出現了一些錯誤和缺項，這對結果可能會(huì )產(chǎn)生一定的偏性影響。另外，為遵循醫學(xué)倫理學(xué)“收益人群最大化”原則，我們將對對照學(xué)校進(jìn)行補干預，使其也能受到本次營(yíng)養宣教干預活動(dòng)所帶來(lái)的益處。
參考文獻
1 李瀅，翟鳳英，常素英，等. 中小學(xué)生營(yíng)養知識、態(tài)度行為調查與分析[J]. 衛生研究，2002，31（6）：454-456.
2 孫靜，馬冠生，胡小琪，等. 對學(xué)生家長(cháng)營(yíng)養知識和行為的現狀調查[J]. 中國學(xué)校衛生，1995,16（5）：384-385.
3 謝斌，趙熙和，賈健斌，等. 北京、廣州、上海城市居民營(yíng)養知識、態(tài)度、行為的調查[J]. 衛生研究，1997,26(5)：343-348.
4 趙麗云，翟鳳英，李丹，等. 中學(xué)生的營(yíng)養知識、態(tài)度和行為在營(yíng)養教育前后的變化[J]. 中國學(xué)校衛生，2002，23(2)：147-148.
5 白錦，李國俊，王淑琴，等. 北京東城區居民營(yíng)養知識水平調查[J]. 衛生研究, 1994, 23:298-230.
6 侯為道，蘇應雄，傅小魯，等. 學(xué)生家長(cháng)營(yíng)養知識態(tài)度行為（KAP）調查分析[J]. 中國學(xué)校衛生，1996,16(6):498-470.
7 黃敬亨. 健康教育學(xué)[M]. 上海：上海醫科大學(xué)出版社，1992.102-109.
8 CARLTON D J, KICKLIGHTER J R, JONNALAGADDA S S, et al. Design, development and formative evaluation of “put nutrition into practice”, a multimedia nutrition education program for adults[J]. J AM Diet Assoc, 2000, 100:555-563.
9 DONNER A, KLAR N. Design and analysis of cluster randomization trials in health research[J]. London：Arnold Press Inc, 2000: 52-76.
作者簡(jiǎn)介：王燦楠，女，教授，E-mail: wcnseu@126.com
1 徐州醫學(xué)院衛生學(xué)教研室
論著(zhù)
β淀粉樣蛋白處理大鼠認知和微量營(yíng)養素狀況的變化
軍事醫學(xué)科學(xué)院衛生學(xué)環(huán)境醫學(xué)研究所，天津 300050
摘要：目的 觀(guān)察認知功能損傷大鼠體內幾種主要維生素和微量元素含量的改變。方法 30只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、β淀粉樣蛋白（Aβ）組和生理鹽水組，每組10只。正常對照組不作任何處理，Aβ組雙側海馬內注射Aβ（每側10μg），生理鹽水組海馬內注射等體積生理鹽水。實(shí)驗周期兩周。通過(guò)水迷宮試驗、避暗試驗檢測大鼠認知功能；采用原子吸收分光光度法、微量熒光法等方法檢測動(dòng)物血清維生素A、維生素E、維生素C、維生素B2、維生素B6、葉酸及微量元素銅、鋅、鐵的含量。結果 海馬內注射Aβ使大鼠認知功能有下降趨勢；與正常對照組及生理鹽水組比較，Aβ組大鼠水迷宮試驗及避暗試驗潛伏期均延長(cháng)，且血清維生素C及鐵含量明顯下降（P<0.05）；各組大鼠其余指標均無(wú)顯著(zhù)性差異。結論 海馬內注射Aβ可導致大鼠認知功能損傷以及血清維生素C、鐵含量降低。
關(guān)鍵詞：認知 微量營(yíng)養素 β淀粉樣蛋白
中圖分類(lèi)號：Q51 R151.43 文獻標識碼：A
Changes of cognition and micronutrient levels in rats treated by βamyloid protein
JIANG Yugang, FANG Hengtong
Institute of Hygiene and Environmental Medicine, Tianjin 300050, China
Abstract: Objective To observe the changes of the cognition and micronutrient level in rats treated byβ amyloid protein. Methods Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, βamyloid group(Aβ) and saline group. The rats were injected Aβand Saline by bilateral intrahippocampus（10μg per lateral）in Aβ group and saline group separately. The experiment lasted 2 weeks.The cognition was identified by water maze and step through test. The contents of serum micronutrients were examined by atomic absorption spectrometry and fluorescence spectrometry. Results Declined cognition and prolonged latency were observed in Aβ group. The contents of serum vitamin C and iron in Aβgroup were significantly lower than those of the control group and saline group（P<0.05）. There was no significant difference among the three groups in other indicators. Conclusion It was seemed that impaired cognition and decreases of serum vitamin C and iron level could be observed in rats treated byβamyloid protein.
Key words: cognition，micronutrient，βamyloid protein
認知功能與營(yíng)養關(guān)系密切。研究表明，維持腦的正常發(fā)育和功能不僅需要碳水化合物、氨基酸、必需脂肪酸等營(yíng)養成分，還需要維生素、礦物質(zhì)等微量營(yíng)養素；維生素和微量元素通過(guò)參與構成酶活性中心，參與神經(jīng)遞質(zhì)的合成，直接或間接地影響腦功能。但有關(guān)認知功能損傷條件下，機體微量營(yíng)養素代謝變化的研究報道很少。為此，本研究擬通過(guò)海馬內注射β淀粉樣蛋白造成實(shí)驗大鼠認知功能損傷，并進(jìn)而觀(guān)察幾種主要維生素和微量元素的含量變化，為尋求保護腦功能營(yíng)養措施的研究提供理論依據。
1材料與方法
1.1動(dòng)物與分組
3~4月齡雄性SD大鼠，體重250~300g，由軍事醫學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機分為正常對照組、β淀粉樣蛋白（Aβ1~40）組和生理鹽水組，每組10只。正常對照組不作任何處理，Aβ組海馬內注射1µl Aβ1~40，生理鹽水組海馬內注射等體積生理鹽水。實(shí)驗周期2周，大鼠自由飲水及攝食AIN－93配方飼料，其間每天記錄大鼠攝食量，每3天稱(chēng)1次大鼠體重。
1.2認知功能損傷模型制備
Aβ1－40的孵育：用無(wú)菌生理鹽水溶解Aβ1－40（Sigma公司），配成10µg/µl的溶液。使用前37℃孵育1周，使其變?yōu)槟蹱顟B(tài)。
制備程序：大鼠用1%戊巴比妥鈉按40mg/kg bw麻醉后，立體定位儀上固定，皮膚消毒，使前后鹵在同一水平，正中切取皮膚暴露顱頂前鹵，參照《大鼠腦立體定位圖譜》選定雙側海馬坐標（P=-4.3mm，D=±1.9mm，H=3.8mm）鉆開(kāi)顱骨，孔徑約1mm，用微量注射器每側海馬內緩慢注射10µg/µl Aβ1~40 1µl，1min注射完畢后留針5min。慶大霉素局部處理后，縫合切口[1]。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 認知功能檢測 水迷宮法：采用大鼠從水迷路的起步點(diǎn)游泳到出口點(diǎn)的時(shí)間（潛逃潛伏期）作為反映大鼠空間辨別學(xué)習記憶功能的指標。
避暗實(shí)驗：以大鼠從明室進(jìn)入暗室的潛伏期作為反映大鼠學(xué)習記憶功能的指標。
1.3.2 維生素及微量元素檢測 (1)維生素B2營(yíng)養狀況：采用全血谷胱甘肽還原酶活性系數(GR AC)評價(jià)[2]。(2)維生素B6營(yíng)養狀況：采用紅細胞天門(mén)冬氨酸轉氨酶活性系數(AST/GOT AC)評價(jià)[3]。(3)天門(mén)冬氨酸轉氨酶活性：采用中生北控試劑盒測定。(4)血清葉酸水平：采用德普診斷產(chǎn)品有限公司放射免疫試劑盒測定。該試劑盒采用化學(xué)發(fā)光競爭免疫分析方法。(5)血清鐵、銅、鋅的含量：采用原子吸收分光光度法測定。(6)血清維生素A、E水平：采用微量熒光法測定。取50μl血清樣本或100μl標準品加入0.25ml蒸餾水震蕩混勻，加入無(wú)水乙醇0.5ml震蕩混勻，加入環(huán)己烷1.5ml震蕩混勻，3000r/min離心10min，取上清液于小比色杯中，測定340nm激發(fā)光下，480nm處的熒光強度，計算維生素A的含量；調整波長(cháng)于295nm激發(fā)光下，340nm處測定熒光強度，計算維生素E含量。(7)血清維生素C水平：采用2,4-二硝基苯肼法測定。在Eppendoff管內加入5%三氯醋酸40μl，然后加入10μl血清或抗壞血酸標準工作液（2μg/ml）混勻，3000r/min離心10min。取上清液30μl與10μl硫脲、硫酸銅、2,4-二硝基苯肼混合液混勻，37℃保溫4小時(shí)。冷卻后，加入85%硫酸50μl混勻，在490nm波長(cháng)下比色。
1.4 統計分析
數據以 x ±s 形式表示，顯著(zhù)性水平為P＜0.05。用SPSS11.5軟件，對檢測結果進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。
2結果
2.1 大鼠攝食及體重結果
Aβ組、生理鹽水組和正常對照組實(shí)驗期間各組平均每天飼料攝入量為（28.4±2.1）、（28.9±3.2）和（28.4±1.7）g；各組之間差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.883）。Aβ組、生理鹽水組和正常對照組實(shí)驗期間體重增加量分別為（79.4±18.6）、（87.6±17.2）和(83.6±16.3)g；各組之間差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.539）。
2.2 空間辨別學(xué)習記憶功能的改變
正常對照組、Aβ組和生理鹽水組大鼠水迷宮潛逃潛伏期分別為（13.1±3.8）、（25.4±18.8）和（17.5±4.9）s，差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.068）。但Aβ組大鼠比正常對照組大鼠潛逃潛伏期有延長(cháng)趨勢。說(shuō)明Aβ組大鼠記憶功能比正常對照大鼠記憶功能有所下降。
2.3避暗實(shí)驗檢測結果
Aβ組大鼠從明室進(jìn)入暗室的潛伏期[（282±78）s]比正常對照組潛伏期[（214±110）s]長(cháng)，但差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.206）。
2.4血清維生素A、維生素E、維生素C含量的測定結果
由表1可見(jiàn)，各組大鼠血清維生素A含量差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.082），各組大鼠血清維生素E含量差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.301）。Aβ組大鼠血清維生素C含量顯著(zhù)低于正常對照組及生理鹽水組（P＜0.05）。
表1 各實(shí)驗組大鼠血清維生素A、E、C含量(x±s) µg/ml
|
組別 |
n |
VA |
VE |
VC |
|
正常對照組 |
10 |
0.18±0.02 |
13.56±1.17 |
28.6±6.9(1) |
|
Aβ組 |
9 |
0.21±0.02 |
13.75±1.46 |
18.5±8.0 |
|
生理鹽水組 |
10 |
0.19±0.04 |
12.97±0.65 |
28.2±4.5(1) |
注：（1）與Aβ組相比P<0.05
2.5 血清維生素B2、維生素B6、葉酸的測定結果
由表2可見(jiàn)，根據全血谷胱甘肽還原酶活性系數升高的程度可以判定核黃素缺乏的程度，AC>1.5為缺乏，各組大鼠均沒(méi)有核黃素缺乏現象，且各組大鼠全血谷胱甘肽還原酶活性系數差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.507），說(shuō)明維生素B2含量無(wú)顯著(zhù)性差異。紅細胞天門(mén)冬氨酸轉氨酶活性系數與機體維生素B6水平有關(guān)，超過(guò)1.8表明處于缺乏狀態(tài)[3]；各組大鼠紅細胞天門(mén)冬氨酸轉氨酶活性系數差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.827），說(shuō)明維生素B6含量無(wú)顯著(zhù)性差異。各組大鼠血清葉酸含量差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.815）。
表2 各組大鼠GR(AC)、AST/GOT(AC)、葉酸測定結果(x±s)
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組別 |
n |
GR(AC) |
AST/GOT(AC) |
葉酸
（ng/ml） |
|
正常對照組 |
10 |
1.02±0.11 |
2.84±1.92 |
8.61±0.74 |
|
Aβ組 |
9 |
1.08±0.11 |
1.91±0.71 |
8.89±1.63 |
|
生理鹽水組 |
10 |
1.04±0.03 |
1.93±0.57 |
8.63±0.63 |
2.6 血清微量元素鐵、銅、鋅的測定結果
由表3可見(jiàn)，Aβ組大鼠鐵含量比正常對照組及生理鹽水組顯著(zhù)低（P＜0.05＝），提示認知功能的維持需要鐵的參與。各組銅含量差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.279）。各組鋅含量差異無(wú)顯著(zhù)性（P=0.926）。
表3 各實(shí)驗組大鼠血清鐵、銅、鋅的含量（x±s） mg/L
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組別 |
n |
Fe |
Cu |
Zn |
|
正常對照組 |
10 |
1.33±0.51(1) |
0.46±0.07 |
0.78±0.09 |
|
Aβ組 |
8 |
0.77±0.29 |
0.42±0.04 |
0.79±0.06 |
|
生理鹽水組 |
10 |
1.87±0.77(1) |
0.48±0.10 |
0.78±0.09 |
注：（1）與Aβ組相比較P<0.05
3 討論
環(huán)境化學(xué)物誘導，機體自身抗氧化能力下降等均可導致認知功能損傷。β淀粉樣蛋白是阿爾茨海默病中老年斑的主要成分，具有神經(jīng)毒性。已有研究表明大鼠腦室內及Meynert基底核注射凝聚態(tài)Aβ對大鼠學(xué)習記憶都有一定損傷；海馬與學(xué)習記憶特別是近事記憶功能密切相關(guān)，是阿爾茨海默病中最易受累的腦區之一，從結構和功能上分析，海馬是學(xué)習記憶功能研究的理想靶區。也有研究者報道通過(guò)海馬內注射Aβ造成大鼠認知損傷，海馬出現病理學(xué)變化[11]。因此，我們選擇大鼠雙側海馬內注射Aβ，觀(guān)察其認知功能損傷時(shí)維生素及微量元素含量的變化。
鐵元素是腦認知形成的重要營(yíng)養素之一。流行病學(xué)資料表明，缺鐵性貧血兒童的腦發(fā)育水平及認知表現均低下，而只有經(jīng)過(guò)長(cháng)期鐵制劑補充才使貧血兒童發(fā)育達到正常水平[12]。色氨酸、去甲腎上腺素、多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)合成相關(guān)的酶發(fā)揮活性需要鐵的參與。已有動(dòng)物實(shí)驗表明，鐵缺乏會(huì )使額葉皮質(zhì)多巴胺受體密度降低而造成認知缺陷。Resburg等發(fā)現，認知衰退老人血清鐵含量較健康老人明顯降低。本實(shí)驗觀(guān)察到認知功能損傷大鼠血清鐵含量顯著(zhù)下降，提示認知功能與鐵營(yíng)養狀況相互影響，鐵缺乏可導致認知功能下降，認知功能下降也可能加重鐵缺乏，互為因果。
氧化損傷是導致認知功能減退的原因之一，維生素C是重要的抗氧化物質(zhì)，Aβ可促進(jìn)自由基的產(chǎn)生，Aβ組大鼠體內VC含量顯著(zhù)下降，提示認知功能減退與抗氧化能力下降有關(guān)。VC、VE可明顯提高神經(jīng)細胞的存活率，拮抗神經(jīng)元氧化損傷。VC可影響去甲腎上腺素等重要神經(jīng)遞質(zhì)的合成，調節多巴胺受體及腎上腺素受體的結合。人體干預實(shí)驗表明，富含抗氧化劑維生素C、E的飲食可預防老年人群阿爾茨海默病的發(fā)生[13]。結合我們的試驗結果，提示β淀粉樣蛋白造成的認知損傷會(huì )使機體抗氧化物質(zhì)含量降低，導致機體對抗氧化應激的能力下降或神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常，從而進(jìn)一步加劇認知損傷。
綜上所述，通過(guò)海馬內注射Aβ建立認知功能損傷的大鼠模型，并觀(guān)察到與腦功能密切相關(guān)的營(yíng)養素——VC及鐵含量顯著(zhù)下降，這是神經(jīng)毒劑Aβ的腦內作用結果，與自然衰老過(guò)程中認知下降有所不同，其機制途徑如何，同時(shí)是否引起了細胞分子水平上神經(jīng)信號的改變，尚需進(jìn)一步研究。
參考文獻
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