陸彩玲  郭松超

廣西醫科大學(xué)公共衛生學(xué)院， 南寧 530021

 

    錳是人體必需的微量元素，而長(cháng)期慢性接觸高濃度錳可引起麻痹震顫，肌肉張力失常為特征的錐體外系損傷的帕金森氏病（Parkinson’s disease, PD）癥狀。PD及慢性錳中毒有許多相似之處，如錐體外系變性，多巴胺耗竭，能量代謝，自由基與興奮性氨基酸及鈣離子紊亂有關(guān) 。近年來(lái)老年特發(fā)性PD發(fā)病率增高及三羰基甲基環(huán)戊二烯合錳（MMT）作為汽油添加劑的廣泛使用，引起了人們對錳與帕金森氏病關(guān)系的關(guān)注。

    細胞凋亡（Apoptosis）或細胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD）是與壞死不同的程控式細胞死亡機制，是維持生長(cháng)發(fā)育及形態(tài)功能所必需的生理現象。非致死性病理性刺激可使細胞通過(guò)活化特定的信號分子，合成凋亡蛋白而進(jìn)入預定的“自殺”程序，神經(jīng)細胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現與非神經(jīng)細胞相似：細胞皺縮、核（染色質(zhì)）濃縮、DNA裂解為185~200bp的片段而使電泳圖譜上出現典型的“Ladder”條帶。

   神經(jīng)細胞凋亡是神經(jīng)退行性疾病如帕金森氏病（Parkinson’s PD）、亨廷氏綜合癥（Hunting’s）、阿爾默茨氏病（Alzheimer’s）等神經(jīng)細胞死亡的方式之一，許多體內外研究已經(jīng)證實(shí)錳可選擇性使多巴胺能神經(jīng)細胞凋亡，本文從氧化應激、線(xiàn)粒體功能異常、Caspase活化、鈣穩態(tài)失調等方面對錳致神經(jīng)細胞凋亡的機制作一綜述。

1         氧化應激

氧化應激（Oxidative stress ,OS）是指機體內氧自由基的產(chǎn)生與清除失去平衡或外源性氧化物的攝入過(guò)多導致反應活性氧（Reactive oxygen Species ,ROS）在體內堆積引起的細胞毒性^[1]。氧化應激已被證實(shí)既參與體外錳誘導幾類(lèi)細胞模型如PC₁₂細胞^[2]及HeLa細胞^[3]的凋亡，及大鼠體內錳神經(jīng)毒性^[4]。多巴胺能PC₁₂細胞對MMT的急性毒性比其他非多巴胺能細胞更敏感，其ROS來(lái)源之一在于多巴胺本身，多巴胺可通過(guò)兩條途徑生成ROS及醌類(lèi)物質(zhì)。其一是單胺氧化酶氧化多巴胺生成H₂O₂及DOPAC^[5]。H₂O₂若不能被細胞的抗氧化物如GSH、GSH-PX清除則可與過(guò)渡金屬反應生成O^2-、OH·，與脂質(zhì)DNA及蛋白上的敏感氨基酸反應對細胞產(chǎn)生損傷，而作為過(guò)渡金屬的錳可降低處理的神經(jīng)細胞的GSH，GSH-PX。另一是多巴胺的兒茶酚胺環(huán)發(fā)生氧化生成多巴胺醌及ROS如H₂O₂、超氧陰離子。Mn可催化多巴胺的自氧化或非酶氧化^[6]。多巴胺醌缺乏電子極易與氨基酸、谷氨酰胺及蛋白質(zhì)上的巰基發(fā)生共價(jià)修飾形成半胱氨酰基-多巴結合物（cys-DA）^[7]。游離巰基作為細胞及蛋白半胱酰氨基殘基上的抗氧化物質(zhì)時(shí)對蛋白質(zhì)功能有重要作用。缺乏使細胞極易受到氧化應激的攻擊。自氧化的多巴胺活化C-JUN,NFK/SAPK較多巴胺更迅速，誘導多巴胺斷裂。而錳亦可活化胞漿JNK通路誘導PC₁₂細胞凋亡^[8]。有可能與錳抑制線(xiàn)體呼吸鏈生成過(guò)多的乳酸使胞漿變酸從而開(kāi)啟JNK通路有關(guān)。因為有報道胞外低PH可誘導A431及Swiss3T3細胞的JNK通路^[9]。介導MMT細胞毒的ROS的另一來(lái)源可能是受損的線(xiàn)粒體^[10]。

抗氧化功能下降是錳致神經(jīng)細胞凋亡的另一機理。GSH可減少多巴胺醌或以其巰基團與多巴胺醌結合^[11]清除醌類(lèi)物質(zhì)，防止其與線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)結合而發(fā)生損傷作用。GSH、GSH-PX活力下降^[12]、抗壞血酸水平的降低^[13]亦在錳的神經(jīng)毒性中起重要作用。另外，在神經(jīng)系統中起抗氧化、營(yíng)養作用的星形膠質(zhì)細胞因富集錳而產(chǎn)生一系列生化改變，包括ROS生成增加，能量生成減少，抗氧化能力降低，谷胺酸鹽載體活性下降等。抗氧化劑—N-已酰半胱氨酸及抗壞血酸可抑制錳所致的PC₁₂細胞的凋亡^[14]。間接提示了氧化機制的存在。

2 線(xiàn)粒體功能異常

線(xiàn)粒體與凋亡有關(guān)的變化包括跨膜電位的下降，反應活性氧的聚積，膜通透性的改變及釋放凋亡因子^[15]。線(xiàn)粒體外被兩層膜，外膜通透性較高，內膜有較高的離子選擇性，有利于形成內外膜兩側的電勢差及跨膜電位質(zhì)子梯度。MMT可直接以劑量依賴(lài)方式降低原代培養的紋狀體神經(jīng)細胞及多巴胺能神經(jīng)細胞的線(xiàn)粒體膜電位，使細胞出現DNA斷片及胞漿檢測到微管蛋白相關(guān)蛋白MAP-2。表明MMT誘導的神經(jīng)細胞凋亡是附屬于線(xiàn)粒體功能異常的^{[10, 16]}。MnCl₂處理多巴胺能神經(jīng)細胞及膠質(zhì)神經(jīng)細胞（C6），前者的線(xiàn)粒體復合物明顯受抑制^[17]，而線(xiàn)粒體復合物I抑制劑誘導的凋亡可能是通過(guò)線(xiàn)粒體通透轉換孔的開(kāi)放及線(xiàn)粒體膜電位崩解所致^[18]。線(xiàn)粒體通透轉換孔的開(kāi)放是對于ROS及電子傳遞鏈抑制劑的應答^[19]。Mn可催化多巴胺生成各種醌及ROS，抑制電子傳遞鏈。通透性的改變引起廣泛的非特異性的凋亡蛋白經(jīng)損傷的線(xiàn)粒體外膜釋放到胞漿，激活caspase級聯(lián)反應，放大凋亡信號。細胞凋亡是基因調控的需能過(guò)程，故ATP水平應與細胞生存及死亡方式密切相關(guān)，存在一能量閾值^[20]。富集線(xiàn)粒體的錳尚可直接作用于線(xiàn)粒體呼吸鏈，抑制順烏頭酸酶，致使線(xiàn)粒體產(chǎn)能障礙，當ATP合成低于該細胞的能量閾值時(shí)將啟動(dòng)細胞的凋亡。

3  Caspase活化

蛋白酶，尤其是稱(chēng)之為caspase，即半胱氨酸蛋白酶，在細胞的凋亡中起重要作用至今已有14種caspase被證實(shí)。它們大多以酶原形式存在于胞漿，并可被凋亡信號活化，介導凋亡級聯(lián)反應。Mn²⁺可誘導Hela^[21]及NIH3T3^[22]細胞的凋亡獨立于線(xiàn)粒體介導的凋亡之外，前者是caspase-3介導，且有ROS及錳超氧化物達的增加，而在NIH3T3細胞上的實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)caspase-3的活化是caspase-12誘導的，可能與Mn²⁺取代Ca²⁺活化蛋白酶Caplain，后者裂解Bcl-xl及caspase-12前體，從而使Bcl-xl抗凋亡作用喪失及caspase-12活化。 Chun HS等^[23]證實(shí)錳使黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細胞SN4741凋亡是內質(zhì)網(wǎng)應激異常、多種 caspase效應分子如：caspase-1、caspase-8、caspase-9參與的結果。Anantharam等以MMT處理PC₁₂細胞使caspase-3迅速活化，繼之是與凋亡有關(guān)的靶物質(zhì)的蛋白水解，尤其是PKCδ裂解為催化活性片段與調節片段，且與caspase-3之間存在著(zhù)正反饋作用，進(jìn)一步擴大了凋亡信號。但亦有研究表明，用caspase-3特異性的抑制劑DEVD-CHO及非特異性的caspase廣譜抑制劑Z-VAD-FMK不能抑制PC₁₂細胞死亡，即Mn誘導PC₁₂細胞死亡也可以是不依賴(lài)于caspase-3活化的^[24]。

4  鈣穩態(tài)失調

鈣離子通過(guò)調節鈣離子依賴(lài)的一系列蛋白酶如磷酸酶、核酸酶、蛋白酶等而在控制細胞的生理過(guò)程、細胞損傷及程序性死亡等方面起重要作用。鈣離子穩態(tài)的維持有賴(lài)于如下幾個(gè)方面的協(xié)調作用：①鈣通道；②Na⁺/Ca²⁺交換系統；③鈣穩態(tài)酶，Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase；④細胞內鈣隔離系統（如線(xiàn)粒體，內質(zhì)網(wǎng)）；⑤鈣調素（CaM）。由于Ca²⁺功能的多樣性及作用靶點(diǎn)、時(shí)程的不同使Mn對鈣穩態(tài)的研究尚未非常明確。

重金屬中毒損傷與胞內Ca²⁺穩態(tài)之間存在著(zhù)密切聯(lián)系^[25]。Mn可通過(guò)不同的機制干擾Ca²⁺的攝入、轉運及釋放而破壞其動(dòng)態(tài)平衡。體外研究證實(shí)Mn²⁺是Na⁺/Ca²⁺交換的抑制劑，能阻斷Na⁺/Ca²⁺交換^[26]，Na⁺/Ca²⁺跨膜轉運的能量依賴(lài)于Na⁺-Ca²⁺-ATPase活化后產(chǎn)生的電化學(xué)梯度。Mn²⁺高濃度時(shí)可抑制Na⁺-k⁺-ATPase^[27]，從而間接抑制Na⁺/Ca²⁺交換。Mn²⁺亦可抑制維持胞內低Ca²⁺濃度的Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase的活性^[28]。該酶是鈣調素(CaM)依賴(lài)性，Mn²⁺離子半徑（0.080nm）與Ca²⁺離子半徑（0.099nm）接近，可取代Ca²⁺激活CaM，胞漿Ca²⁺濃度過(guò)高，持續時(shí)間過(guò)長(cháng)，CaM的活性異常升高，對細胞產(chǎn)生多種損害作用。Mn²⁺或許通過(guò)上述幾個(gè)方面致Ca²⁺平衡失穩態(tài)。

胞漿內游離Ca²⁺的升高可激活某些蛋白酶，磷脂酶和內源性核酸酶，這些酶的活化可誘導細胞凋亡，另鈣離子濃度升高可激活胞內信號轉導途徑，涉及到翻譯后修飾調節凋亡下游效應器的蛋白酶和/或磷酸酶。Mn²⁺與Ca²⁺競爭線(xiàn)粒體膜上的同一單向轉運體進(jìn)入線(xiàn)粒體，且自線(xiàn)粒體清除速度極慢，抑制Na⁺依賴(lài)性的及非Na⁺依賴(lài)性的Ca²⁺移出線(xiàn)粒體^[29]，引起線(xiàn)粒體鈣離子負載而使構成鈣離子外流的通透轉換孔（PT）開(kāi)放，線(xiàn)粒體膜電位崩解，細胞色素C從線(xiàn)粒體釋放到胞漿，激活caspase，表現出DNA碎片，凋亡小體等特征性變化^[30]。

綜上所述，錳，作為人體必需的微量元素之一，長(cháng)期高濃度的暴露使之選擇性沉積在紋狀體，多巴胺能神經(jīng)細胞對其毒性更敏感。攝入的錳被隔離在線(xiàn)粒體，通過(guò)反應活性氧（來(lái)源于錳催化多巴胺氧化及受損的線(xiàn)粒體）、破壞鈣穩態(tài)，使線(xiàn)粒體通透性增加，PT孔開(kāi)放釋放出凋亡因子到胞漿激活Caspase介導神經(jīng)細胞的凋亡。

 

 

1 Simonian NA, Coyle JT. Oxidative stress in neurodegerative diseases. Ann Rev pharmacol Toxicol，1996 , 36: 83-106

2  Desole MS, Esposito G, Migheli R，et al. Glutathione deficiency potentiates manganese toxicity in rat striatum and brainstem and in PC-12 cell. Pharmacol Res，1997，316 : 285-295

3 Oubrahim H, Stadtman ER, Chock PB. Mitochondria  play no roles in Mn(II)-induced apoptosis in Hela cells. Proc Natl Acad Sci USA，1998 , 9505-9510

4 Desole MS, Scila L, Delogu MR，et al. Role of oxidative stress in the manganese and 1-methyl-4(2-ethylpenyl)-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced apoptosis in Pc12 cell.  Neurochem  INT，1997, 31: 169-176

5 Maker HS, Weiss C, Silides DJ，et al. Coupling of dopamine oxidation （monoamine oxidase activity）to glutathione oxidation via the generation of hydrogen peroxide in rat brain homogenates J . Neurochem . 1981,36 : 589-596

6         Shen XM, Dryhurst G. Iron-and manganese-catalyzed autoxidation of dopamine in the presence of l-cysteine: Possible insights into iron-and manganese-mediated dopamonergic neurotoxicity  Chem. Res  toxicol，1998 ,11 : 824-837

7  Hastings TG. Zigmiond MJ.  ldentification of Catecholprotein conjngates in neostriatal slices in cubated with【³H】dopamine: impact of ascorbic acid and glutathione J.Nearochem 1994,63 : 1126-1132

8  YoKo, Hirata, KaYo, adachi, kazutoshi Kiuchi.  Actiuction of JNK pathway and induction of apoptsis by Manganese in PC₁₂   cell. Neurochem，1998，71: 1607-1615

9         Xue L , Lucocq JM.  Low extacellular PH induces actiration of erk2, JNK and p38,in A431 and Swiss 3T3 cells. Biochem Biophys Kes Commun, 1997,241 :236-242

10  Kitazawa M, Wagner JR, Kirby ML, et al. Oxidative stress and mitochondrial-mediated apoptosis in dopaminergic cells exposed to methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl  pharmacol Exp Ther, 2002,302（1）: 26-35

11     Tse D.C,S, Mccreery R.L, Adams RN  Potentoal oxidative pathways of brain Catecholamines. J Med Chem, 1976,19: 37-40

12  Rabinovich AD, Hastings TG . Role of endogenous glutathione in the oxidation of Dopamine.  J  Neurochem, 1998 , 71 : 2071-2078

13  Desole MS, Esoposito G, Migheli R, et al. Cell defence mechanisms in the striatum of yough and aged rats subchronically exposed to manganese. Neuropharmacology, 1995,34(3): 289-295

14  Hirata Y, Adachi K, Kiuchi K . Activation of JNK pathways  and  induction of apoptosis by Mn in PC₁₂ cells.  J  Neurochem. 1998, 71 : 1607-1615

15 Kruman 1, Guo Q, Mattson MP. Calium and reactive oxygen species mediate staurosporine-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis in PC12 cells. J Neurosci Res,  1998, 51: 293-308

16  Malecki EA. Manganese toxicity is associated with mitochondrial dysfunction and DNA fragmentation in rat primary striatal neurons. Brain Res Bull, 2001,55(2) : 225-258

17 Galvani  P, Fumagalli P, Santagostino A.Vulnerability of mitochonclrial Complex I in PC₁₂ cells exposed to Manganese.  Eur J pharmacol, 1995,293（4）: 377-383 

18  Scarlet JL, Murphy MP.  Release of apoptosis proteins from the mitochondrial intermembrane space during the  mitochondrial Permeability transition.  FEBS lett, 1997, 418（3）: 282-286

19     assarino DS, Parks JK, Parker WD, et al.  The parkinsonian nearotoxin  MPP⁺ opens the mitochondrial permeabblity transition pore and release cyto chrome C in isolated mitochondria via an oxidative mechanism Biochim. Bio phys Acta, 1999,1453（1）: 49-62

20  Hockenkery DM, oltvai ZN, Yin XM, et al. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apotosis. Cell, 1993, 75 : 241

21     brahim H, stadtman ER, chock P B.（2001）Proc Natl . Acad Sci USA. 98, 9505-9510

22     Hammon aubrahim , P. Boon Chock , Earl  k  Manganese （Ⅱ）induces apoptotic cell death in NIH3T3 cells via a caspase-12-dependent pathway

23     Chun HS , Lec H, Son. JH .  Manganese induces endoplasmic reticulum （ER）Stress and activates multiple caspases in nigral dopaminergic neuronal cells SN4741. Neurosci Lett, 2001, 316（1）: 5-8

24 Velarddy anantharam, Masushi kitazawa, Jarrad wayner, et al. Caspase-3-dependent proteolytic clearage of protein kinase Cδ  is essential for oxidative Stress-mediated dopaminergic cell death after exposure to methylclopentadienyl manganese tricarbonyl . J  Neurosci, 2002, 22(5) :1738-1751

25 Chao SH, Suzuki Y, Zysk JR, et al . Activation of CaM by various ions as a function of ionic radius. Molicular Pharmacol, 1984,26(1) : 75

26 李兆萍，等. 離體大鼠心肌細胞鈣超負荷與缺氧—復氧損傷. 生理學(xué)報, 1989，41（3）: 304

27 Shukla GS, et al. Effect of manganese on rat brain microsomal Mg²⁺-Na⁺-k⁺-ATPase : In vivo and in vitro studies . Environ Res, 1983, 32: 212

28 Vig PJ, et al. Meetal inhibition of  calmodulin  activity  in  monkey brain.  J Appl Toxicol, 1989, 9(5) : 313

29 Givin CE, Gunter KK, Gunter TE. Manganese and  calcium transport in mitochondria: implications for  manganese toxicity .  Neurotoxicology, 1999, 20 (2-3): 445-453

30 Smaili SS, Hsu YT, Carvalho AC, et al . Mitochondria, calcium and pro-apoptosis proteins as mediators in cell death signaling . Braz J Med Biol Res, 2003, 36(2): 183-190