韓軍花 楊月欣 門(mén)建華 王竹（中國疾病預防控制中心營(yíng)養與食品安全所， 北京 100050）
　　鋅作為人體重要的必需微量元素，對維持細胞膜的結構和功能必不可少[1]。離子轉運是細胞膜的重要功能，研究認為，對維持紅細胞膜兩側的離子平衡起重要作用的K+、 Na+離子轉運系統主要有Na+/K+泵、Na+/K+/Cl-聯(lián)合轉運系統（COTS-1）、Gardos通道（Gardos channel）、K+/Cl- 聯(lián)合轉運系統（COTS-2）以及殘余滲漏（residual channel RF）等[2]。目前國內外關(guān)于鋅與細胞膜轉運關(guān)系的研究，多限于鋅對Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性的影響，而關(guān)于鋅與紅細胞膜上COTS-1、COTS-2、Gardos通道和RF等轉運系統的關(guān)系尚未見(jiàn)報道。本研究從體內和體外兩方面觀(guān)察鋅對紅細胞膜Na+/K+泵、COTS-1、COTS-2、Gardos通道及RF等離子轉運通道的影響，為進(jìn)一步解釋鋅的作用機制提供依據。
1 材 料 與 方 法
1.1 主要生化試劑
　　ATP-Na2 ，丁苯氧酸（Bumetanide），MOPS等為Sigma 公司產(chǎn)品，烏苯苷 E Mark
公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)優(yōu)級純或分析純。各種試劑均用去離子水配制，所用容器均按微量元素實(shí)驗室常規進(jìn)行處理，在實(shí)驗過(guò)程中嚴格避免各種污染。
1.2 動(dòng)物飼料
　　采用美國AIN-76配方并進(jìn)行適當調整，實(shí)測低、正常和高鋅飼料中鋅含量分別為2.2、28和128mg/kg。
1.3 動(dòng)物分組及飼養
　　選用健康雄性Wistar斷乳鼠30只，平均體重34.37g。按體重將動(dòng)物隨機分為低鋅（LZ）、正常鋅（NZ）和高鋅（HZ）三組，每組10只，分別喂飼低、中、高鋅飼料。動(dòng)物用不銹鋼代謝籠單籠飼養，自由飲去離子水。4周后， 低鋅動(dòng)物出現明顯的進(jìn)食量減少、體重增長(cháng)緩慢、易激惹等體征后由腹主動(dòng)脈取血進(jìn)行各通道活性的測定。
1.4 體外實(shí)驗
　　提取新鮮的健康成年人紅細胞，加入不同濃度的鋅溶液（0，5，10，50，100和500μmol/L Zn2+）進(jìn)行溫浴，測定各濃度下5種離子轉運通道的活性。
1.5 Na+/K+泵、COTS-1、COTS-2的測定方法
　　按照Shoeat等[3] 的方法進(jìn)行。新鮮血離心提取紅細胞，將紅細胞用冰冷的Na+/K+泵洗液洗滌3次，每次5min，調整紅細胞懸液濃度為50% Hct左右，各反應管中加入不同的離子后，Na+/K+泵測定管加入1.2mmol/L烏苯苷，COTS-1測定管中加入1.2mmol/L丁苯氧酸，COTS-2測定管中加入12mmol/L丁苯氧酸，并設對照管。各管均加入50% Hct紅細胞0.1ml，加樣后輕輕混勻，置37℃水浴60min，迅速加入冰冷的Na+/K+泵反應終止液，每管0.6ml，離心洗滌三次，每次5min；最后每管加入15%三氯乙酸0.6ml，振蕩混合后靜置消化8~10h，離心，吸取上清并稀釋10倍后原子發(fā)射法測定各個(gè)樣品管中的Na+、K+含量。
1.6 Gardos通道、RF的測定方法
　　按上述Shoeat等[3]的方法，制備并調整紅細胞懸液濃度為50%Hct左右，Gardos通道測定管中加6mmol/L的鹽酸奎寧，RF的測定管中加入6mmol/L 鹽酸奎寧和12mmol/L丁苯氧酸，設對照管，各管均加入50%Hct紅細胞0.1ml，加樣后輕輕混勻，其余步驟同上。原子發(fā)射法測定各個(gè)樣品管中的K+含量。
1.7 數據處理
　　SPSS統計軟件，ANOVA進(jìn)行顯著(zhù)性檢驗。

2 結 果
2.1 鋅攝入水平對大鼠體重的影響（表1）
　　三組動(dòng)物初始體重均衡性良好，2周后低鋅、高鋅組動(dòng)物出現體重增長(cháng)緩慢，4周后低鋅、高鋅兩組大鼠體重明顯低于正常鋅組（P＜0.01）。

　　表1 鋅對大鼠體重的影響 (?X ?s)

組別	動(dòng)物數	平均體重 (g)		體重增長(cháng)值 (g)
		初始值	終值
LZ	10	34.83 ± 6.94	77.22 ± 15.2 a	42.39 ± 10.0 b
NZ	9	34.96 ± 4.60	95.72 ± 11.6	60.76 ± 8.3
HZ	10	33.67 ± 5.21	78.38 ± 9.35 a	44.71 ± 7.1 b

2.2 鋅與Na+/K+泵活性（圖1）
　　圖1A顯示不同鋅攝入量對大鼠紅細胞Na+/K+泵轉運活性的影響，飼料中鋅含量為28mg/kg（正常鋅組）時(shí)，K+ 離子通過(guò)Na+/K+泵的跨膜轉運活性最大，低鋅組和高鋅組大鼠轉運活性均降低；Na+的跨膜轉運隨攝入鋅量增加其變化趨勢與K+似乎相反，高鋅組活性最大。圖1B顯示體外加入不同濃度后的鋅Na+/K+泵活性的變化趨勢，在加入鋅濃度為5μmol/L時(shí)，K +離子的轉運活性最高，其后則開(kāi)始下降，Na+離子的轉運在5μmol/L時(shí)也最活躍，但總的趨勢不如K+ 。

(A)

(B)

2.3 鋅與COTS-1的轉運活性〔圖2〕
　　圖2A表示不同鋅攝入量對大鼠COTS-1轉運的影響，K +離子通過(guò)COTS-1的轉運隨鋅攝入量的增高呈下降趨勢，Na+的變化趨勢與K+相反，隨飼料鋅的增加而呈上升趨勢。圖2B表示體外實(shí)驗的結果，COTS-1的K+轉運活性在加入5μmol/L Zn2+時(shí)變低，隨后又有升高趨
勢，但當加入鋅濃度大于50μmol/L時(shí)活性又開(kāi)始下降。鋅濃度對Na+的影響比K+小，從整個(gè)
曲線(xiàn)來(lái)看Na+的變化趨勢與K+基本一致。

2.4 鋅與 COTS－2、Gardos 通道及 RF的轉運活性（圖 3）
　　由圖3A可知，COTS-2和Gardos通道的轉運活性均在正常組最大，攝入低鋅或高鋅飼料均抑制動(dòng)物體內這兩個(gè)通道的轉運活性；而RF的轉運活性在低鋅攝入時(shí)最大，隨著(zhù)大鼠攝入鋅量的增加，該通道轉運活性呈下降趨勢。
　　體外實(shí)驗的結果顯示，隨著(zhù)溶液中加入鋅的增加，COTS-2和Gardos通道的轉運活性都呈現先上升后下降的趨勢，在加入5μmol/L Zn2+時(shí)活性最大，但Gardos通道在溶液中加入鋅為500μmol/L時(shí)活性又回升；RF的體外轉運結果與體內基本一致，隨著(zhù)溶液中加入鋅的增加，RF的轉運呈下降趨勢，當溶液中加入500μmol/L Zn2+時(shí)，K離子的轉運方向從原來(lái)的由內向外變?yōu)橛赏庀騼龋闯霈F逆向的離子轉運。如圖3B所示。

3 討論
　　Na+/K+泵又叫Na+，K+-ATP酶，與Ca2+泵（Ca2+，Mg2+-ATP酶）都屬于基本主動(dòng)轉運途徑[4]。Na+/K+泵對維持細胞內外的滲透壓平衡和跨膜電化學(xué)梯度起非常重要的意義，該通道轉運活性降低將影響細胞的正常生命活動(dòng)。本次體內外實(shí)驗結果均表明，適量充足的鋅是保證K+離子主動(dòng)轉運活性的關(guān)鍵，過(guò)高或過(guò)低鋅都會(huì )抑制Na+/K+泵轉運K+的能力；鋅對該通道Na+轉運的影響不如K+變化幅度大，可能與Na+/K+泵的轉運機制有關(guān)，也可能是由于Na+同時(shí)還存在其它類(lèi)似的轉運途徑如Na+/Na+交換、Na+/氨基酸系統等，對Na+轉運的降低起緩沖作用所致。
　　COTS-1屬于次要主動(dòng)轉運途徑，有很強的離子選擇性，其重要的功能就是在Na+/K+泵活性降低時(shí)，它能代償性地調節細胞膜兩側的Na+、K+濃度[5]。動(dòng)物實(shí)驗結果表明低鋅時(shí)K+離子通過(guò)COTS-1的轉運最為活躍。如前所述（圖1A），低鋅時(shí)Na+/K+泵的轉運活性降低，COTS-1通過(guò)其部分代償作用來(lái)維持細胞內的高K+狀態(tài)；體外實(shí)驗的結果也證明，在Zn2+濃度<50μmol/L時(shí)，COTS-1轉運K+的活性隨鋅濃度的變化與Na+/K+泵相反，這進(jìn)一步證明了它對Na+/K+泵的代償作用。但當溶液中加入鋅濃度＞50μmol/L時(shí)，COTS-1轉運K+的能力又開(kāi)始下降，說(shuō)明過(guò)高濃度的鋅可抑制該通道對Na+/K+泵的代償作用。從總的趨勢來(lái)看，Na+通過(guò)COTS-1的轉運與K+的變化基本一致，但規律性不如K+明顯（圖2B）。
　　COTS-2是一個(gè)與COTS-1不同的K+/Cl-聯(lián)合轉運途徑，屬于載體介入性，正常情況下，該通道對維持細胞內外的K+平衡起一定的作用。體內外的實(shí)驗結果證明，適量充足的鋅也是保證該通道轉運活性的關(guān)鍵，過(guò)高或過(guò)低的鋅均會(huì )抑制COTS-2的正常跨膜轉運功能（圖3A、B）。目前有關(guān)COTS-2的研究比較少，有待進(jìn)一步深入。
　　Gardos通道又稱(chēng)為Ca2+激活性K通道，是由Gardos1958年首次證明的。生理情況下由于Ca2+泵連續主動(dòng)地泵出Ca2+，胞漿內的Ca2+濃度極低，不足以激活該通道，只有當胞漿內Ca2+濃度升高到一定水平時(shí)該通道才能開(kāi)放。國內外資料顯示，低鋅和高鋅均可使Ca2+泵活性降低[6] [7]，理論上該通道活性應增強，但本實(shí)驗結果表明，低鋅和高鋅時(shí)該通道的活性低于正常鋅，提示鋅對該通道的影響較為復雜，可能還存在其它機制。
　　RF是指在所有已知轉運途徑均被抑制后的跨膜離子轉運。生理情況下，RF對維持細胞膜兩側的離子平衡起一定作用[8]。本實(shí)驗結果顯示，隨著(zhù)鋅濃度的升高，RF的活性下降，也表明了該通道對其他通道活性降低的部分代償作用。體外實(shí)驗當加入500μmol/L Zn2+時(shí)，RF呈現逆向的離子轉運，提示當細胞內外的離子濃度有較大的變化時(shí)，RF可通過(guò)逆向轉運K+來(lái)平衡細胞內外的離子濃度（圖5A、B）。
總之，無(wú)論是體內還是體外，鋅的水平高低與細胞膜的離子轉運功能密切相關(guān)。適量的鋅是保證　　Na+/K+泵、COTS-2、Gardos通道轉運活性的關(guān)鍵，過(guò)高或過(guò)低都會(huì )影響其轉運功能，而COTS-1和RF對細胞膜兩側的離子紊亂可起到部分代償作用，提示了機體的統一性和協(xié)調性。這些結果顯示，鋅對細胞膜轉運功能的影響也許是解釋鋅作用的重要機制之一。

4. 參考文獻
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EFFECT OF ZINC ON THE TRANSPORT FUNCTION OF ERYTHROCYTE MEMBRANE

HAN Jun-hua，YANG Yue-xin，MEN Jian-hua，WANG Zhu
(Institute of Nutrition and Food Hygiene, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100050)

　　【Abstract】Objective: To study the effects of zinc on transport function of erythrocyte membrane. Methods: This study was conducted both in vivo and in vitro. In vivo, weanling rats were divided into three groups and fed with different zinc diets(2.2,28 and 128mg Zn/kg diet) for four weeks, the transport function of Na+/K+ pump, COTS-1,COTS-2,Gardos and RF channels were determined; In vitro, different concentration of zinc(0,5,10,50,100 and 500μmol Zn2+/L) were added into fresh human blood and the activities of the five transport channels were detected. Results: Proper zinc could keep the highest activities of Na+/K+ pump, COTS-2 and Gardos channel. Too low or too high zinc decreased the transport function of these three channels and the activities of COTS-1 and RF channel were increased with the increase of zinc concentration, indicating the competitive function of these two channels. Conclusion: Zinc plays an important role in maintaining the transport function of erythrocyte membrane.
　　Key words: zinc; erythrocyte membrane; transport function