單延春 盛曉陽(yáng) 洪昭毅 薛敏波（上海第二醫科大學(xué)附屬新華醫院兒保科，上海 200092）
　　鋅對免疫系統的發(fā)育和正常免疫功能的維持有著(zhù)不可忽視的作用（1）。鋅缺乏導致機體免疫功能降低，補充鋅劑可增強機體抵抗力，但是鋅通過(guò)何種機制影響機體免疫功能尚需進(jìn)一步探討。近年來(lái)一系列研究發(fā)現，在體外培養細胞中，高濃度的鋅可抑制凋亡，而用絡(luò )合劑去除鋅則有促進(jìn)細胞凋亡的作用(2,3)。胸腺是中樞免疫器官，是T淋巴細胞分化成熟的場(chǎng)所；脾臟是外周免疫器官，是T、B淋巴細胞進(jìn)行免疫應答的場(chǎng)所。研究鋅缺乏對胸腺、脾臟淋巴細胞凋亡的影響，對于闡明鋅影響機體免疫功能的機制有重要意義。本文通過(guò)控制飲食建立生長(cháng)期缺鋅大鼠模型，從活體觀(guān)點(diǎn)研究鋅缺乏對胸腺、脾臟淋巴細胞凋亡的影響，為臨床應用鋅劑作為免疫輔助劑提供理論依據。

1 材料與方法
1.1 動(dòng)物分組
　　采用中科院上海動(dòng)物所提供的剛斷奶的雄性SD大鼠30只，按體重配對分為3組，缺鋅組10只，配飼組10只，正常對照組10只。
1.2 動(dòng)物模型的建立
　　飼料配方：樣品采用灰化法經(jīng)原子吸收分光光度儀測定。
　　(1)正常鋅飼料：參照美國營(yíng)養協(xié)會(huì )推薦的AIN-76配方（4）配制成的半合成飼料，含鋅量30mg/kg。
　　(2)在正常配方的無(wú)機鹽中去除鋅鹽，配成缺鋅飼料。含鋅量＜1mg/kg。
　　飼養方法：動(dòng)物房潔凈無(wú)塵，室溫控制在24℃左右，濕度50%，光照及黑夜由人工控制，各12小時(shí)。在不銹鋼籠具內單籠飼養，定期用雙蒸水沖洗。缺鋅組自由食用缺鋅飼料；正常對照組自由食用正常飼料；配飼組食用正常飼料，但進(jìn)食量控制為缺鋅組大鼠前一天進(jìn)食量。各組大鼠自由飲用去離于水。 于第11天處死大鼠取血和胸腺、脾臟進(jìn)行各項指標檢測。
1.3 檢測指標及方法
　　微量元素鋅的測定 使用Perkin-Elmer公司 4100型原子吸收分光光度儀火焰法測飼料和血 清鋅。
　　胸腺、脾臟的組織學(xué)觀(guān)察 大鼠處死后迅速去胸腺、脾臟，置與于4％多聚甲醛磷酸緩沖液中固定，常規制作石蠟切片，HE染色后普通光鏡下觀(guān)察。
　　胸腺、脾臟組織細胞原位凋亡的測定 采用TUNEL方法（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick ended-labeling method），嚴格按照試劑盒說(shuō)明操作，DAB顯色，二甲苯透明、封片后，顯微鏡下觀(guān)察結果。每張切片高倍視野下隨機取六個(gè)視野，用德國西門(mén)子公司KS4000型圖像分析系統進(jìn)行陽(yáng)性率和強陽(yáng)性率的分析。
1.4 統計分析
　　采用STATISTICA統計軟件進(jìn)行分析。
　　基金項目：香港中文大學(xué)資助課題。
2 結 果
2.1 缺鋅飼料對生長(cháng)期大鼠一般情況和血清鋅的影響
　　缺鋅組大鼠于缺鋅飼料喂養3～4天出現食欲不振，繼而出現腹瀉、生長(cháng)遲緩、皮炎等缺鋅癥狀。該組大鼠于實(shí)驗第4～5天起體重明顯落后于對照組和配飼組，處死前三組大鼠體重及其增長(cháng)速度有顯著(zhù)差異，三組大鼠的飼料效價(jià)（總增重/總飼料消耗）也有明顯差異（表1）。 缺鋅組大鼠血清鋅濃度顯著(zhù)低于配飼組和對照組。
表1 鋅對大鼠體重增長(cháng)和飼料效價(jià)的影響

組別	例	初重（ g ）	終重（ g ）	增長(cháng)值（ g ）	飼料效價(jià) (g/g)	血清鋅 ( μ mol/L)
缺鋅組	10	50.1 ± 2.51	60.8 ± 4.32 a ,b	10.6 ± 2.12 a ,b	0.164 ± 0.022 a ,b	10.60 ± 1.847 a ,b
配飼組	10	50.1 ± 2.60	74.9 ± 3.57 a	24.8 ± 1.99 a	0.387 ± 0.038 c	20.46 ± 3.892
對照組	10	50.2 ± 3.33	100.7 ± 5.62	50.5 ± 3.66	0.336 ± 0.016	21.50 ± 3.559

2.2 鋅對胸腺、脾臟重量，胸腺、脾臟指數的影響
　　缺鋅組大鼠胸腺與對照組和配飼組相比有明顯萎縮，脾臟體積和重量也明顯低于對照組和配飼組（表2）。
表2 飼料鋅對胸腺、脾臟重量的影響

組別	例數	胸腺重（ g ）	胸腺指數	脾臟重（ g ）	脾臟指數
缺鋅組	10	0.0997 ± 0.0062 a ,b	1.643 ± 0.089 a ,b	0.1330 ± 0.0104 a ,b	2.189 ± 0.114 a ,b
對照組	10	0.4042 ± 0.0123	4.020 ± 0.139	0.5022 ± 0.0169	4.993 ± 0.141
配飼組	10	0.3078 ± 0.0108 a	4.113 ± 0.109	0.3692 ± 0.0170 a	4.931 ± 0.111

2.3 胸腺、脾臟的病理觀(guān)察
　　胸腺：缺鋅組大鼠胸腺明顯萎縮，皮質(zhì)變薄、疏松，淋巴細胞數量明顯減少，皮髓質(zhì)分界模糊，皮質(zhì)內可見(jiàn)體積縮小、核固縮的細胞，胸腺小體數量也明顯減少（圖1、2）。 配飼組與對照組無(wú)明顯差異。
　　脾臟：缺鋅組大鼠脾臟白髓數量和體積均明顯減少，淋巴細胞數量也明顯減少，動(dòng)脈周?chē)馨颓首儽。▓D3、4）。 配飼組與對照組無(wú)明顯差異。

圖 1 ：缺鋅大鼠胸腺 *40

圖 2 ：對照大鼠胸腺 *40

圖 3 ：缺鋅大鼠脾臟 *40

圖 4 ：對照大鼠脾臟 *40

圖 5 ： TUNEL 檢測缺鋅大鼠胸腺 *400

圖 6 ： TUNEL 檢測對照大鼠胸腺 *400

圖 7 ： TUNEL 檢測缺鋅大鼠脾臟 *400

圖 8 ： TUNEL 檢測對照大鼠脾臟 *400

2.4 胸腺、脾臟淋巴細胞末端標記原位凋亡的測定
　　用TUNEL方法對三組大鼠的胸腺和脾臟進(jìn)行原位凋亡的測定，陽(yáng)性細胞染成棕黃色。結果顯示：缺鋅組大鼠胸腺皮質(zhì)和脾臟白髓中的凋亡細胞明顯多于對照組和配飼組（圖5-8）。圖像分析結果顯示：缺鋅組大鼠胸腺細胞陽(yáng)性率和強陽(yáng)性率明顯高于配飼組和對照組，脾臟白髓內淋巴細胞陽(yáng)性率和強陽(yáng)性率也明顯高于配飼組和對照組；配飼組除胸腺細胞陽(yáng)性率高于對照組外，其余與對照組無(wú)差別（表3）。
表3 飼料對大鼠胸腺、脾臟淋巴細胞凋亡的影響 %

組別	例數 （ n ）	胸腺 陽(yáng)性率	強陽(yáng)性率	脾臟 陽(yáng)性率	強陽(yáng)性率
缺鋅組	10	11.88 ± 3.10 a ,b	3.81 ± 1.31 a ,b	19.31 ± 3.63 a ,b	6.91 ± 2.02 a ,b
配飼組	10	5.90 ± 2.92 c	1.31 ± 0.71 d	1.02 ± 1.02 d	0.14 ± 0.10 d
對照組	10	1.68 ± 0.71	0.60 ± 0.24	3.54 ± 2.80	0.45 ± 0.31

討 論
　　鋅以鋅離子、鋅依賴(lài)酶或其它鋅蛋白的形式存在于體內，具有廣泛的生理功能。其中，鋅對免疫系統的發(fā)育和正常免疫功能的維持有著(zhù)不可忽視的作用。尤其在兒科臨床中，鋅劑用以預防和輔助治療兒童感染性疾病更值得引起重視（5，6）。兒童期的免疫系統處在快速發(fā)育但功能尚不成熟的階段，無(wú)論在結構還是功能上都有自己的特點(diǎn)，與成人有顯著(zhù)差異。本研究采用生長(cháng)期大鼠構建缺鋅動(dòng)物模型，目的是更好地代表兒童期免疫系統的特點(diǎn)。
　　本實(shí)驗模型采用半合成飼料，人為控制鋅攝入量。結果發(fā)現缺鋅組大鼠從第3～4天開(kāi)始出現食欲不振，繼而出現腹瀉、生長(cháng)遲緩、皮炎等，飼料效價(jià)明顯降低，血清鋅濃度明顯低于配飼組和對照組。表明復制的缺鋅大鼠模型是成功的。研究發(fā)現缺鋅組大鼠胸腺、脾臟重量，胸腺、脾臟指數均顯著(zhù)低于對照組和配飼組，提示缺鋅特異性抑制了免疫器官發(fā)育，導致胸腺、脾臟萎縮，與文獻報道一致（7）。病理結果發(fā)現，缺鋅時(shí)胸腺皮質(zhì)明顯變薄，淋巴細胞減少， 脾臟白髓數量和體積均減少，這可解釋鋅缺乏時(shí)機體的免疫功能降低的原因。 那么，鋅缺乏是通過(guò)何種機制使得免疫器官發(fā)生如此改變呢？
　　近年來(lái)一系列研究發(fā)現，在體外培養細胞中，高濃度的鋅可抑制凋亡，而 用絡(luò )合劑去除鋅則有促進(jìn)凋亡的作用，但尚未看到活體實(shí)驗的報道。細胞凋亡 是一種由基因控制的細胞自主性死亡方式，是一種主動(dòng)的、程序性的、細胞固有的生物學(xué)過(guò)程，以凋亡小體形成、染色體DNA斷裂、胞膜及核膜皺縮為特征。在免疫系統的發(fā)育和功能行使過(guò)程中，細胞凋亡始終扮演重 要角色，淋巴細胞的分化、成熟乃至死亡過(guò)程都伴隨著(zhù)凋亡（8）。胸腺是T細胞發(fā)育成熟的場(chǎng)所，來(lái)自骨髓的T細胞必須經(jīng)過(guò)陽(yáng)性及陰性選擇，才能發(fā)育成熟。 胸腺內的選擇過(guò)程導致95％以上的胸腺細胞死亡，其主要的死亡方式是凋亡。 1992年Gavrid等首先提出利用TdT介導的DNA缺口末端標記技術(shù)可原位檢測細胞核的DNA斷裂從而識別凋亡細胞（9）。本實(shí)驗用TUNEL方法研究表明，缺鋅組大鼠胸腺皮質(zhì)和脾臟白髓中的凋亡細胞明顯多于對照組和配飼組。說(shuō)明鋅缺乏導致發(fā)育中的和成熟的淋巴細胞凋亡增多，這可能是缺鋅時(shí)胸腺萎縮、淋巴細胞數量減少，機體免疫力低下的主要機制之一。這一結果與體外細胞培養實(shí)驗結果一致（3）。
　　本實(shí)驗結果提示，生長(cháng)期鋅缺乏大鼠胸腺、脾臟萎縮，胸腺細胞和脾臟淋巴細胞凋亡增多，導致免疫活性細胞減少，可能是其機體免疫力下降的機制之一。

4 參 考 文 獻
　　1. Fraker P. J, King LE, Laakko T, et al. The dynamic link between the integrity of the immune system and zinc status. J. Nutr 2000, 130 (5s) Suppl: 1399s-1406s.
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The effect of zinc deficiency on apoptosis of immunocytes in growing rats.

Shan yanchun, sheng xiaoyang, hong zhaoyi,et al.(Department of Child Health Care,Xinhua Hospital,Shanghai Second Medical University. Shanghai,200092)

　　Abstract: [Objective] To observe the effect of dietary zinc deficiency on thymocytes and spleen 1ymphocytes, and its re1ationship to apoptosis in growing rats. [Methods] After deve1oping a zinc-deficient rat mode1, using TUNEL(termina1 deoxynucleotidy1 transferase-mediated dUTP nick endlabe1ing)method, the apoptosis of thymocytes and sp1een 1ymphocytes was checked. [Resu1ts] The cortex of thymus and white pu1p of sp1een were appeared atrophy in zinc deficient group. The percentage of apoptosis in the thymus and white pulp of sp1een were higer in zinc deficient group than in contro1 group and paired-fed group. (P<0.01). [Conc1usion] Dietary zinc deficiency 1eads to increased apoptosis of 1ymDhocvtes. which ma\r he one of the poptos is of 1ymphocytes, which may be one of the important mechanisms of decreased immune function.
　　Keywords: Zinc Immunocytes Apoptosis