|
摘要目的：研究視黃酸(RA)促進(jìn)臍血淋巴細胞(CBL)抗體生成的作用機制。方法：對臍血標本進(jìn)行血清維生素A濃度測定，采用RT-PCR法檢測CBL中視黃酸受體-a(RAR-a)的基因表達水平，并采用ELISA法檢測細胞培養上清液中lgM含量。結果：臍血血清維生素A水平與未培養CBL中RAR-a的基因表達水平之間存在正相關(guān)：r=0.50(P<0.01)；RA增加SAC活化CBL的IgM生成能力(P<0.001)：RA上調SAC活化CBL中RAR-a的基因表達水平(P<0.001)；RA使RAR-a基因表達的上調幅度與RA使IgM生成的上調幅度之間存在正相關(guān)：r=0.40(P<0.05)。結論：RA對CBL抗體生成的促進(jìn)作用可能通過(guò)RAR-a途徑傳遞。
關(guān)鍵詞：視黃酸受體 基因表達 臍血淋巴細胞 抗體生成中圖分類(lèi)號：R151.2
近年來(lái)的研究已證實(shí)維生素A對免疫系統，對T、B淋巴細胞功能具有調節作用[1]。維生素A的主要活性產(chǎn)物視黃酸能促進(jìn)體外培養的臍血單核細胞產(chǎn)生免疫球蛋白[2]，但其作用途徑和機制有待進(jìn)一步闡明。為此，我們測定分析了臍血血清維生素A水平，并采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術(shù)，檢測分析RA對臍血淋巴細胞(CBL)中視黃酸受體-a（RAR-a)基因表達水平的調節，以探討RA對臍血淋巴細胞抗體生成能力的促進(jìn)作用是否通過(guò)RAR-a調節的途徑。
1 材料與方法
1.1臍血血清維生素A測定
臍血獲自上海市金山區金衛鄉衛生院母嬰健康且營(yíng)養狀態(tài)良好的順產(chǎn)兒，本文參考劉繼鵬等[3]的方法，采用微量熒光分光光度法測定臍血血清維生素A濃度。
1.2淋巴細胞體外培養
臍血分離單核細胞后，用含15%小牛血清(GIBCO產(chǎn)品)的RPMI 1640培養液(GIBCO產(chǎn)品)懸浮細胞為每毫升106個(gè)，培養在96孔U型板中，加入SAC(CALBIOCHEM產(chǎn)品)，濃度為1×10-6mol/L，在培養24h后收獲細胞，留置未培養的單核細胞作為對照。培養7d后收集細胞上清液進(jìn)行IgM含量測定。
1.3 RT-PCR檢測RAR-a mRNA
總RNA抽提：培養前后的臍血淋巴細胞采用TRIzol試劑(GIBCO產(chǎn)品)提取制備總RNA，用紫外分光光度計(日本島津UV-1601)測定OD260進(jìn)行準確定量。
引物設計：參考國外文獻資料并采用計算機輔助設計，RAR-a的上下游引物分為5'-GCGGGCACCTCAATGGGTAC-3' 和5'-GGACATGCCCACTTCAAAGC-3'。引物由中科院上海生化所合成。
RT-PCR：取1mg總RNA經(jīng)MMLV逆轉錄酶(GIBCO產(chǎn)品)催化合成cDNA第一鏈，并以此為模板進(jìn)行PCR擴增，PCR反應體積為50m1，經(jīng)30～35循環(huán)后，取擴增產(chǎn)物10m1走2％瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，在紫外燈下觀(guān)察結果并照相(英國UVP公司紫外凝膠成像及分析儀).
1.4 細胞上清液中IgM含量的測定
采用ELISA雙抗夾心法檢測上清液中IgM含量。
1.5 結果分析與顯著(zhù)性檢驗
采用紫外凝膠成像及分析系統(英國UVP公司)對電泳凝膠中的PCR產(chǎn)物條帶進(jìn)行定量分析；配對資料比較的顯著(zhù)性檢驗采用配對t檢驗，直線(xiàn)相關(guān)系數的顯著(zhù)性檢驗根據r值直接查r界值表。
2 結果
2.1臍血血清維生素A水平及其與CBL中RAR-a基因表達水平的相關(guān)性
臍血血清維生素A水平的平均值為1.06±0.35mmol/L。對臍血血清維生素A水平與未培養CBL中RAR-a的基因表達水平之間作相關(guān)分析發(fā)現，兩者之間存在顯著(zhù)正相關(guān)：r=0.50,Ｐ<0.01(圖1)。
2.2 RA對體外培養CBL的IgM生成能力的促進(jìn)作用
RA(1×10-6mol/L)增加SAC刺激的CBL的IgM生成能力，由0.44±0.36mg/L(SAC刺激)增加到1.20± 0.72mg/L(SAC + RA 共同培養)(g=6.096,P<0.001)(圖2)。
2.3 RA對體外增養的CBL中RAR-a基因表達的調節
CBL在單純SAC刺激培養24h后，RAR-a的mRNA水平為未培養時(shí)的1.21±0.18倍，加入RA與SAC共同培養24h后，CBL中RAR-a的mRNA水平增加至未培養時(shí)的1.45±0.22倍，RA對RAR-a mRNA水平的上調具有顯著(zhù)性意義(r=6.025,P<0.001)(圖3)。
2.4 CBL中RAR-a基因表達水平與IgM合成水 平受RA上調幅度之間的相關(guān)性。 RA使RAR-a基因表達的上調幅度與RA使IgM生成的上調幅度之間存在正相關(guān)關(guān)系：r=0.40,P<0.05(圖4)。
３ 討論
自1913年維生素A被發(fā)現以來(lái)，人們就觀(guān)察到維生素A具有抗感染作用。Scrimshaw[4]指出"和維生素A缺乏相比，沒(méi)有一種其他營(yíng)養素的缺乏與感染性疾病之間具有更密切的相關(guān)關(guān)系"。維生素A對T、B淋巴細胞的活化、增殖和分化具有重要的調節作用[1]。本次研究再次表明類(lèi)維生素A的代表分子RA能夠促進(jìn)體外培養的CBL的IgM生成能力，但其作用途徑和機制需進(jìn)一步闡明。
1987年視黃酸受體(RARs)的發(fā)現[5]，大大促進(jìn)并深化了對維生素A增強免疫功能的機制研究。視黃酸受體屬于類(lèi)固醇/甲狀腺激素核內受體超家族成員，包括3種亞型：RAR－a、RAR-b和RAR－g,其中RAR-a在細胞中的表達最為廣泛。Halevy和Friedman等[6,7]的研究發(fā)現類(lèi)維生素A誘導小雞/小鼠T淋巴細胞中RAR-a基因的表達，同時(shí)發(fā)現T細胞的增殖反應被增強。近幾年來(lái)，本課題組的研究發(fā)現人外周血淋巴細胞中主要表達RAR-a，少量表達RAR-g，不表達RAR-b基因，而且RAR-a基因的轉錄表達受絲裂原和RA的調節,提示RAR-a可能參與RA對淋巴細胞的調節功能。
本次研究檢測了30例臍血標本的血清維生素A水平，同時(shí)檢測了未培養CBL中RAR-a的基因表達水平，并首次發(fā)現臍血血清維生素A水平越高，RAR-a的基因表達水平也越高，兩者之間存在顯著(zhù)正相關(guān)。說(shuō)明人體維生素A營(yíng)養水平與RAR-a表達水平之間密切相關(guān)。
本次研究再次表明RA能夠上調SAC活化CBL中RAR-a的基因表達，更為重要的是，我們發(fā)現RA使RAR-a基因表達的上調幅度與RA使IgM生成的上調幅度之間存在正相關(guān)關(guān)系。這些研究結果說(shuō)明類(lèi)維生素A水平、RAR-a基因表達水平和IgM生成之間存在密切關(guān)系，提示RA對CBL的IgM生成的促進(jìn)作用可能通過(guò)RAR-a途徑傳遞，RA可能通過(guò)上調RAR-a的表達進(jìn)而促進(jìn)CBL的抗體生成。
RAR-a是類(lèi)維生素A依賴(lài)的轉錄因子，位于細胞核內基因轉錄的調控區，受其調節的基因有50余種，包括RAR-b、層粘蛋白B1、補體因子H和垂體生長(cháng)激素等基因[9]。RAR-a可能在基因轉錄水平上直接調節免疫球蛋白基因的轉錄表達，也可能通過(guò)調節細胞因子等基因表達的間接途徑而調節免疫球蛋白的生成。
兒童的免疫系統尚處于發(fā)育成熟階段，由T、B淋巴細胞介導的細胞免疫和體液免疫功能尚待完善，這使兒童易患各種感染性疾病。兒童易發(fā)生維生素A缺乏，早產(chǎn)兒中更明顯，這更不利于兒童的抗病免疫能力。最近Rahman等[10]對6月齡以?xún)葖雰哼M(jìn)行的維生素A補充試驗發(fā)現。補充維生素A后血清維生素A水平達到正常的嬰兒的細胞介導免疫功能顯著(zhù)優(yōu)于安慰劑組，表明維生素A對于兒童免疫系統的發(fā)育和功能具有促進(jìn)作用。進(jìn)一步闡明類(lèi)維生素A對T、B淋巴細胞功能的調節機制，將為在臨床上使用類(lèi)維生素A制劑，在兒童中開(kāi)展維生素A補充干預試驗，提供理論和實(shí)驗依據。
參考文獻
1. Richard S. The role of vitamin A and related retinoids in immune function. Nurtition Review, 1998;56:s38.
2. Wang W, Ballow M. The effects of retinoic acid on in vitro immunoglogulin synthesis by cord blood and adult peripheral blood mononuclear cells. Cell Immunol, 1993;148:291.
3. 劉繼鵬，奚金寶，閻志等. 血清維生素A微量熒 光測定法的改進(jìn)和應用.營(yíng)養學(xué)報，1985;7:136.
4. Scrimshaw NS, et of. Interactions of Nutrition and Infection. Geneva: World Health Organization, 1968.
5. Martin P et al. A human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear receptor. Nature, 1987;330:444.
6. Halevy O et al. Retinoic acid receptor-a gene expression is modulated by dietary vitamin A and by retinoic
*女，1971年出生，碩士研究生，本研究獲國家自然科學(xué)基金資助，項目號：39470613
acid in chicken T lymphocytes. J Nutr,1994;124:2139.?7. Friedman A et al. Retinoic acid promotes prolifetation and induces expression of retinoic acid receptor- a genein murine T lymphocytes. Cellular Immunology, 1993;152:240.
8. 王衛平，楊毅，蘇貽新.人外周血淋巴細胞視黃酸 受體基因的表達與調控.營(yíng)養學(xué)報，1998;20:275
9. Yuichi Hashimoto. Retinobenzoic acids and nuclear retinoic acid receptors. Cell Structure and Function, 1991;16:113.
10. Rahman MM et al. Effect of early vitamin A supplementation of cell-mediated immunity in infants younger than 6 mo. Am J Clin Nutr, 1997;65:144. | 