摘要

　　研究鋅對紅細胞膜脂、膜蛋白的抗氧化保護作用。實(shí)驗采用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶、Fe2+/H2O2兩種體系產(chǎn)生的O2、OH·對紅細胞膜進(jìn)行氧化損傷。通過(guò)電子自旋標記、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和化學(xué)發(fā)光技術(shù)從不同側面研究鋅在抗氧化方面的作用及機制。結果OH·和O2可致膜脂質(zhì)流動(dòng)性降低、膜蛋白分子交聯(lián)：適量的鋅可以抑制自由基的產(chǎn)生，保護膜脂質(zhì)和膜蛋白免受自由基的氧化，使膜流動(dòng)性、膜蛋白的電泳圖譜基本恢復正常。研究結果表明鋅對自由基的氧化損傷有保護作用。

關(guān)鍵詞 鋅 紅細胞膜 自由基損傷

　　作為一種人體必需微量元素，鋅廣泛分布于人體，發(fā)揮多種生理功能。缺鋅對人體尤其是孕婦、胎兒和兒童所造成的危害已引起人們的重視，鋅作用機制的研究一直為國際前沿的熱門(mén)課題。以前的研究認為鋅可作為超氧化物歧化酶的輔酶催化超氧離子發(fā)生歧化反應，適量的鋅還可以誘導體內金屬硫蛋白的產(chǎn)生[1]，而金屬硫蛋白被認為是一種很好的自由基清除劑。研究還發(fā)現鋅與某些抗氧化物螯合后其抗氧化作用明顯高于抗氧化劑單獨作用。自由基所造成的氧化損傷被認為是多種疾病的起點(diǎn)，細胞膜是氧化損傷的主要目標之一。目前鋅直接保護細胞膜的報道還不多見(jiàn)。本文主要觀(guān)察了鋅對細胞膜的主要組成成分膜脂、膜蛋白的氧化損傷的保護作用，以進(jìn)一步探討和理解鋅的作用機制。

材料與方法

材料

　　新鮮人血系來(lái)自北京市血站，在一周內使用。

主要試劑

　　硫酸鋅，5-DOXYL Stearic acid（5-DOXYL），黃嘌呤，黃嘌呤氧化酶（Grade 1），魯米諾，十二烷基硫酸鈉（SDS），丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，過(guò)硫酸胺，考馬斯亮蘭，溴酚藍，二硫蘇糖醇（DTT），2-巰基乙醇（ME）等。以上試劑均購于Sigma公司。硫酸亞鐵銨，雙氧水（均為分析純，系國產(chǎn)）。

紅細胞膜的制備[2]及膜蛋白含量的測定：

　　用Lowry法測定膜蛋白。充氮氣4℃冰箱保存，一周內使用。

標記分組

　　將紅細胞膜（蛋白含量為2.0g/L）分為3組:正常對照組、損傷組、加鋅保護組。鋅的終濃度為100mmol/L，37℃溫育30min。分別用以下兩個(gè)體系進(jìn)行損傷：Fe2+/H2O2體系（用2%H2O2+200mmol/L硫酸亞鐵銨），黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系（黃嘌呤用飽和溶液，黃嘌呤氧化酶為9×105U/L）。

自旋標記[3]

　　5-DOXYL用無(wú)水乙醇配成10-2mol，取適量自旋標記物，分別加入各組膜中，使標記物終濃度達10-4mol。37℃溫育1h，用PBS洗兩次。

ESR波譜測試條件

　　處理好的膜沉淀封入石英毛細管中，在Varian E-109型ESR波譜儀上測試。X-波段，微波動(dòng)率：20mW，調制：2mT，室溫檢測。

SDS-PAGE電泳

　　將紅細胞膜（膜蛋白含量為2.0g/L）分為正常對照組、損傷組及不同濃度的加鋅保護組（10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L）。加鋅組在損傷前先與鋅37℃溫育15min。再用氧化體系Fe2+/H2O2（3% H2O2+300μmol/L Fe2+）損傷，30min后終止反應，進(jìn)行電泳。電泳方法參照臨床生化檢驗[4]。

化學(xué)發(fā)光[5]

　　將紅細胞膜（膜蛋白含量為2.0g/L）30μl，不同濃度鋅15μl，黃嘌呤飽和溶液100μl，1mol/L魯米諾840μl，5×10-2單位黃嘌呤氧化酶10ml，混合。以加入黃嘌呤氧化酶后開(kāi)始記時(shí)，上FT-632型生物化學(xué)光度計測試，記錄一分鐘的發(fā)光值。

　　計算與統計學(xué)分析

　　據公式[6,7]計算序參數S和旋轉相關(guān)時(shí)間τ。統計分析采用t檢驗。

結 果

鋅對紅細胞膜脂的保護作用

　　脂肪酸自旋標記物5-DOXYL可以插入細胞膜類(lèi)脂雙層骨架中，它主要反映紅細胞膜表層脂鏈的運動(dòng)狀態(tài)。提取純凈的紅細胞膜（蛋白含量為2.0g/L）分為3組（正常對照組、損傷組、加鋅保護組）。分別用Fe2+/H2O2體系和黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生OH·和O2-對膜進(jìn)行損傷，ESR測定結果如圖（1～4）所示：

鋅對紅細胞膜蛋白的保護作用

　　經(jīng)OH·損傷后的細胞膜進(jìn)行蛋白電泳圖譜顯示：Fe2+/H2O2氧化體系所產(chǎn)生的OH·對膜蛋白有較強的損傷效果，其中距起始點(diǎn)最近的蛋白帶和約在94000、67000的蛋白被降解成部分蛋白片段交聯(lián)，造成條帶模糊或成線(xiàn)狀分離不開(kāi)。加鋅對膜蛋白有保護作用，且隨濃度的增加，保護作用增強，但100μmol/L組與1000μmol/L組差異并不顯著(zhù)。說(shuō)明在此損傷濃度下100μmol/L的鋅即可充分保護膜蛋白免受氧化損傷。

　　鋅對黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光（CL）的影響

　　化學(xué)發(fā)光法是檢測自由基的靈敏、準確的方法，其原理是魯米諾被活性氧自由基氧化成激發(fā)態(tài)的氨基肽鹽離子，當其返回基態(tài)時(shí)放出大量光子，從而對CL起放大作用。自由基產(chǎn)生越多，其發(fā)光值就越大，反之亦然。根據發(fā)光值的大小可反映系統中自由基的量。

　　化學(xué)發(fā)光的結果如附表所示：

　　記錄1min時(shí)的發(fā)光值，從結果可以看出，隨著(zhù)鋅濃度的增加，其發(fā)光值有明顯的降低。說(shuō)明鋅對黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系所引發(fā)的自由基有抑制作用，且抑制作用隨濃度增加而增強。

附表 不同濃度的鋅對自由基的影響

　　在研究中我們使用了電子自旋標記（ESR）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和化學(xué)發(fā)光技術(shù)在體外分別從紅細胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、膜脂流動(dòng)性和膜蛋白等方面研究了鋅的抗氧化作用。

　　當前，大量的研究表明，適當的生物膜流動(dòng)性是表現生物膜正常功能的必要條件。在本研究中ESR標記結果顯示，鋅可使OH·和O2-造成的紅細胞膜流動(dòng)性降低基本恢復到正常對照水平。說(shuō)明鋅對由OH·和O2-造成的紅細胞膜膜脂的氧化損傷有保護作用。在反應中，鐵復合物與氧、過(guò)氧化物（如H2O2、ROOH、ROOR等）或其它的電子受體反應可引發(fā)自由基的產(chǎn)生。鋅可與鐵競爭從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的多個(gè)環(huán)節，其通過(guò)競爭與膜表面結合的位點(diǎn)即配位體，可使Fe復合物產(chǎn)生減少，通過(guò)Haber-Weiss反應使OH·水平降低，造成脂類(lèi)轉變?yōu)榛钚匝酰≧O·，RO2·，ROOH等）的鏈式反應被抑制。氧化還原反應所產(chǎn)生過(guò)氧化物（如H2O2、ROOH、ROOR等）或其它的電子受體減少，致使下面的反應被進(jìn)一步抑制。此外，在氧化反應中所產(chǎn)生的一些有害的脂質(zhì)過(guò)氧化物比其自由基前體能擴散更遠的距離，引發(fā)更廣泛的損傷，如羥壬烯醇就有很強的細胞毒性[8]，鋅可抑制一些有害的脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生。這樣就從多個(gè)方面抑制了氧化損傷的發(fā)生，保護了紅細胞膜膜脂。

　　SDS-PAGE電泳結果顯示鋅對Fe2+/H2O2體系引發(fā)的紅細胞膜的非還原性交聯(lián)有保護作用。Fe2+/H2O2體系作用于紅細胞膜通過(guò)Haber-Weiss反應（H2O2+ Fe2+X→OH·+OH-+ Fe3+X）產(chǎn)生了大量的OH·，OH·是一種氧化性很強的自由基，它可直接作用于氨基酸，促進(jìn)蛋白質(zhì)的交聯(lián)，自由基的濃度與氨基酸的破壞程度有關(guān)[9]。蛋白交聯(lián)可以通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化介導，紅細胞膜的蛋白骨架與磷脂雙分子層周邊相連，在脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程所產(chǎn)生的過(guò)氧基和烷氧基可引發(fā)多肽自由基產(chǎn)生，引起交聯(lián)[10]。OH·也可能直接攻擊紅細胞膜的蛋白骨架引發(fā)蛋白自由基的交聯(lián)過(guò)程。實(shí)驗在電泳之前加入了DTT，抑制了巰基之間的交聯(lián)，反應以非還原性交聯(lián)為主。電泳圖譜顯示：鋅對反應所引起的交聯(lián)有抑制作用，且抑制作用隨濃度的增加增強。我們認為可能因為鋅與鐵通過(guò)競爭膜表面結合位點(diǎn)，干擾了鐵離子的氧化還原，使Haber-Weiss反應中產(chǎn)生的OH·減少，抑制了通過(guò)上述兩種途徑交聯(lián)的發(fā)生。此外，一些有害的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物如丙二醛（MDA）也可與氨基酸反應生成烯胺，使得氨基酸分子交聯(lián)。鋅對紅細胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化有抑制作用，它可使氧化過(guò)程所產(chǎn)生的MDA量減少，減少交聯(lián)的發(fā)生。保護了紅細胞膜膜蛋白。

　　化學(xué)發(fā)光強度與膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平密切相關(guān)。我們應用它來(lái)研究脂質(zhì)過(guò)氧化的變化。結果顯示，鋅對黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系所引發(fā)的自由基有抑制作用，且抑制力隨濃度的增加而增強。這可能是由于鋅與紅細胞膜結合，抑制了膜脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中所產(chǎn)生的自由基及其激發(fā)態(tài)基團，從而降低了反應所產(chǎn)生的自由基對膜的損傷。

　　生物膜的氧化損傷可影響細胞的正常功能，是很多疾病的起點(diǎn)。鋅對紅細胞膜質(zhì)和膜蛋白的抗氧化保護作用將對維持膜正常結構和功能，及自由基損傷引起的疾病的防治具有重要意義。

參考文獻

1.楊月欣，劉建宇.鋅誘導金屬硫蛋白體內合成的

實(shí)驗研究.微量元素與健康，1996,13（1）：1.

2.Dodge JT, Mitchell C, Hanahan DJ.The preparation and chemical characteristics of hemoglobin free ghost of human erythocyte. Action Biochem Biophys， 1963，100:119.

3.趙保路.用脂肪酸自旋標記研究中國地鼠肺正常細胞V79和癌變細胞V79-B1膜的流動(dòng)性.科學(xué)通報，1982，27：686.

4.上海醫學(xué)化驗所主編,臨床生化檢驗. 上海：科學(xué)技術(shù)出版社，1985：246.

5.李益新，方允中.超氧化物歧化酶的輻射失活與自由基作用關(guān)系的研究.生物化學(xué)與生物物理學(xué)進(jìn)展，1983，（3）：38.

6.張建中.自旋標記ESR譜圖基本理論和應用. 北京：科學(xué)出版社，1987：43.

7.程時(shí)，謝一琳，華鑰.金屬硫蛋白對大鼠紅細胞膜受羥自由基損傷保護作用的自旋標記-ESR研究.生物物理學(xué)報，1992,8：104.

8.Slater TF. Free radical mechanisms in tissue injury. Biochem J，1984，222:1.

9.Chvapil M, Montgomery D, Ludwig JC et al. Zinc in erythrocyte ghosts. Proc Soc Exp Biol Med， 1979，162:485.

10.邵 洪.氧自由基與蛋白質(zhì)代謝.國外醫學(xué)分子生物學(xué)分冊,1990，12（1）：42.