Ｎａｍａｎ ｊｅｅｔ Ａｈｌｕｗａｌｉａ，Ｊｉａｎｑｉｎ Ｓｕｎ，Ｄｅａｎｎａ Ｋｒａｕｓｅ，Ａｎｄｒｅａ Ｍａｓｔｒｏ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｈａｎｄｔｅ 薛 琨 王 勁譯
　　摘要：背景 衰老常常伴隨免疫功能失調。鐵缺乏可進(jìn)一步損害老年人的免疫力。已發(fā)表的報道中關(guān)于鐵缺乏和人體免疫應答的關(guān)系并不一致。大部分研究關(guān)注發(fā)展中國家的幼兒，并且常常混雜有其它疾病狀況、感染及營(yíng)養素缺乏等因素。目的 我們的目的是為了確定居家老年婦女鐵營(yíng)養狀況與免疫功能的關(guān)系，這些老年婦女常常同時(shí)有鐵營(yíng)養狀況和免疫反應的損害。根據嚴格的排除標準選擇研究對象，如排除患病、感染和缺乏影響免疫力的主要營(yíng)養素。方法 ７２名居家老年女性提供血樣，用以全面評價(jià)鐵營(yíng)養狀況和細胞免疫，先天性免疫狀況。研究對象根據多項鐵營(yíng)養狀況異常測試結果分為鐵缺乏和鐵充足兩組，分別比較兩組之間的淋巴細胞分類(lèi)、吞噬作用、突發(fā)性氧化能力和有絲分裂原激發(fā)的Ｔ細胞增殖。結果 在鐵缺乏女性中，伴刀豆球蛋白Ａ和植物凝集素Ａ激發(fā)的Ｔ細胞增殖只有鐵充足女性的４０％～５０％。兩組間吞噬作用沒(méi)有明顯差別，但鐵缺乏女性突發(fā)性呼吸明顯比鐵充足組低２８％。結論 鐵缺乏與細胞免疫和先天性免疫損傷有關(guān)，并使老年人更容易發(fā)生感染。還需要進(jìn)一步的前瞻性研究來(lái)同時(shí)檢驗鐵缺乏對免疫反應和發(fā)病率的影響，并用類(lèi)似的排除標準，即患病、感染和伴隨營(yíng)養素缺乏。
　　關(guān)鍵詞：鐵營(yíng)養狀況；細胞免疫；吞噬作用；突發(fā)性氧化能力；老年婦女

　　良好的營(yíng)養對維持免疫非常重要。衰老常常與免疫能力的下降相關(guān)聯(lián)，尤其是Ｔ細胞介導的免疫功能。營(yíng)養素缺乏可進(jìn)一步造成老年人免疫功能下降，并使他們比營(yíng)養素充足者更容易罹患急慢性感染和疾病。不少研究著(zhù)眼于不同營(yíng)養素在維持老年女性免疫功能中的作用。但鐵缺乏對老年女性免疫反應的作用還沒(méi)有得到充分驗證，僅發(fā)現在體弱的、居家的或托養于專(zhuān)門(mén)機構的老年人中鐵缺乏的現患率相當高。在一項關(guān)于托養機構的老年人營(yíng)養狀況與對流感疫苗反應的研究中，Ｆｕｌｏｐ等報道對疫苗無(wú)反應的人群中，血紅蛋白、紅細胞容積和血清鐵濃度明顯低于對疫苗有反應人群，提示老年人鐵缺乏可能存在細胞免疫反應低下。
　　人類(lèi)鐵營(yíng)養狀況與免疫功能的關(guān)系最初是在嬰幼兒、成年人的研究中提出來(lái)的，細胞免疫損傷（ＣＭＩ）和殺菌功能低下常見(jiàn)于鐵缺乏人群：但觀(guān)察到的結果并不一致。就鐵缺乏和免疫力的矛盾結果可能與研究對象的年齡、存在炎癥或共存其它營(yíng)養素缺乏、應用的鐵缺乏的定義不同、或不同研究所用的免疫功能評價(jià)方法不同有關(guān)。因此我們的興趣在于全面確定居家老年女性鐵營(yíng)養狀況與細胞免疫、自然免疫損傷程度的關(guān)系，這部分人群處于發(fā)生鐵缺乏的危險中；用嚴格的篩選標準調整了健康不良、炎癥和其他營(yíng)養素缺乏等混雜因素的影響。

對象和方法

對象
　　根據賓夕法尼亞３個(gè)鄉村（ＢＬＡＩＲ、ＣＥＮＴＲＥ、ＣＬＥＡＲＦＩＥＬＤ）老人院的醫療記錄確定居家老年女性（＞６０歲，ｎ＝２２５），均接受來(lái)自老人院的餐飲或日常生活活動(dòng)等服務(wù)，并沒(méi)有已知影響免疫應答的慢性病。通過(guò)參加本研究的傳單或邀請信聯(lián)系研究對象，其中１１９名婦女表示對參加本研究感興趣。根據ＳＥＮＩＥＵＲ 協(xié)議的原則，需要獲得被聯(lián)系婦女的口頭病史，以排除任何慢性病或急慢性感染和當前使用任何影響免疫應答的藥物。８０名女性符合該協(xié)議的健康標準，其中７２名同意提供血樣并參加本研究。沒(méi)有人在進(jìn)入本研究前３個(gè)月中常規服用過(guò)鐵補充劑。對象根據由賓夕法尼亞州立大學(xué)守法辦（Ｏｆｆｉｃｅ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）批準的協(xié)議簽訂了知情同意書(shū)。對象在完成研究后收到５０美元作為酬謝。
研究協(xié)議
　　表面健康的、居家女性（７２名），在家中休息１５ｍｉｎ后提供空腹血樣。用便攜式標準化儀器記錄身高、體重，并且根據ＳＥＮＩＥＵＲ協(xié)議排除體質(zhì)指數（ｋｇｍ２）＜２０的女性。由有資格證書(shū)的放血醫生收集靜脈血（約３５ｍｌ）放入裝有肝素、ＥＤＴＡ、或沒(méi)有添加物（無(wú)微量元素試管）的３種清洗干凈的試管中，用實(shí)驗室檢測來(lái)篩查健康和營(yíng)養狀況。
健康篩查
　　在Ｃｏｕｌｔｅｒ ＭＡＸＭ 分析儀上進(jìn)行全血細胞計數和細胞分類(lèi)。用羅氏Ｍｉｒａ ｐｌｕｓ ｒａｎｄｏｍａｃｃｅｓｓ 化學(xué)分析儀進(jìn)行臨床化學(xué)健康檢查。這些檢測的結果由醫生評價(jià)排除感染、炎癥、肝病、腎病、骨髓增殖異常或這些病的其他合并癥，４名對象被排除。
　　為了評價(jià)炎癥狀況，用Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法檢測了紅細胞沉降率。用放射免疫擴散法測定血清α酸性糖蛋白。白細胞計數升高也被作為炎癥狀況的指標。異常結果的界值為：紅細胞沉降率＞３０ｍｍｈ，白細胞計數＞１１×１０３ｍｍ３，α酸性糖蛋白＞１．４ｇＬ。３項炎癥檢測結果出現兩項以上異常者從分析中排除（ｎ＝３）。
營(yíng)養狀況篩查標準
　　實(shí)驗室檢測以確定蛋白質(zhì)、維生素Ｂ１２、葉酸、鋅是否充足，因為這些營(yíng)養素缺乏與免疫反應低下有關(guān)。檢測血清總蛋白和血清白蛋白濃度反映部分臨床化學(xué)特征。用商業(yè)放射分析試劑盒測定了維生素Ｂ１２、葉酸濃度。用原子吸收分光光度法測定血漿鋅。
　　兩名血清總蛋白濃度＜６０ｇＬ，血清白蛋白＜３５ｇＬ或兼有兩種情況的對象從分析中排除。為了排除存在維生素Ｂ１２或葉酸缺乏的人，兩名血清維生素Ｂ１２濃度２５０ｎｇＬ，血清葉酸濃度＜２μｇＬ，或平均細胞體積＞１０２ｆＬ的對象從分析中被排除。沒(méi)有人存在鋅不足（血漿鋅＜６００μｇＬ）。兩名婦女的血樣不夠完成所有的篩查和免疫功能測試，不得不從分析中排除。
鐵營(yíng)養狀況的檢測以及鐵充足或鐵缺乏的特征
　　進(jìn)入研究的７２名女性中，５９名符合入選標準，通過(guò)一系列實(shí)驗室檢測項目對她們進(jìn)行了全面的鐵營(yíng)養狀況評價(jià)。血清鐵蛋白用放射免疫試劑盒測定。血清轉鐵蛋白受體用酶聯(lián)放射免疫分析試劑盒測定。血清鐵、總鐵結合力和轉鐵蛋白飽和度用美國醫學(xué)實(shí)驗室的比色法測定。血紅蛋白、紅細胞容積和其他紅細胞指標通過(guò)ＣＢＣ分析獲得。鐵儲存耗竭和鐵營(yíng)養狀況異常測試結果≥兩項的女性被認定為是鐵缺乏。
免疫功能
　　考慮到血樣量，根據以前建立的、在我們實(shí)驗室生效的方案，用全血測定免疫功能指標。
淋巴細胞表型
　　在１ｍｌ肝素處理的血樣中，用流式細胞儀和對表面抗原有特異性的、熒光標記單克隆抗體對淋巴細胞進(jìn)行分類(lèi)估計。比如，抗ＣＤ３識別總Ｔ細胞，抗ＣＤ４識別總輔助Ｔ細胞，抗ＣＤ８識別總細胞毒Ｔ細胞，抗ＣＤ５６、１６識別ＮＫ細胞，抗ＣＤ１９識別Ｂ細胞。通過(guò)分類(lèi)估計ＣＢＣ獲得總淋巴細胞數，總淋巴細胞數用來(lái)計算不同淋巴細胞亞群的絕對數。
有絲分裂原激發(fā)的Ｔ細胞增殖
　　通過(guò)測量３Ｈ胸腺嘧啶的結合６．７Ｃｉｍｍｏｌ，得到不同濃度的植物紅細胞凝集素（ＰＨＡ）和伴刀豆球蛋白Ａ（Ｃｏｎ Ａ）引起的Ｔ細胞增殖。基于我們先前的研究，ＰＨＡ和ＣｏｎＡ濃度分別是５ｍｇＬ和１０ｍｇＬ以及３ｍｇＬ、１２ｍｇＬ和２５ｍｇＬ。肝素處理的血樣以１∶１０的比例用ＲＰＭＩ １６４０稀釋?zhuān)渲邪保埃ヌヅＱ濉ⅲ酞补劝彼猁}２ｍｍｏｌＬ、青霉素１００ ０００ＵＬ和鏈霉素１００ｍｇＬ。在９６孔的圓底微量滴定板上，每孔加入稀釋的血樣和有絲分裂原每孔１００μＬ。對于每個(gè)濃度的有絲分裂原，每個(gè)對象做６個(gè)平行樣。細胞孵育４２ｈ（濕潤，５％ＣＯ２，３７℃）然后在每個(gè)小孔中加入１０μＬ３Ｈ胸腺嘧啶。之后，細胞再孵育６ｈ，然后用玻璃纖維濾膜（Ｓｋａｔｒｏｎ ７０２５ Ｃｏｍｂｉ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ Ｓｋａｔｒｏｎ公司 Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）收集細胞。用 Ｗａｌｌａｃ １２０５ Ｂｅｔａ 板式計數器（ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ 公司 Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ ＭＤ）測定摻入到細胞ＤＮＡ中的３Ｈ胸腺嘧啶。將血液中Ｔ 細胞濃度標準化后，并用每１０００個(gè)Ｔ 細胞來(lái)表示結果。
吞噬細胞、吞噬作用、突發(fā)性氧化能力
　　單核細胞可以通過(guò)流式細胞儀用對表面抗原有特異性的熒光標記單克隆抗體檢測例如，抗ＣＤ１４識別單核細胞。用ＣＢＣ通過(guò)分類(lèi)計數得到的總的淋巴細胞數量，可以用來(lái)計算單核細胞的絕對數量。粒細胞的數量也用ＣＢＣ通過(guò)分類(lèi)計數獲取。
　　吞噬作用用流式細胞儀和試劑盒測定。肝素處理的血樣與異硫氰酸熒光素標記的、經(jīng)調理素作用的大腸桿菌在３７℃下孵化１０ｍｉｎ，然后將未被攝取細菌的熒光猝滅。用ＥＰＩＣＳ ＸＬ流式細胞儀測定含熒光的粒細胞（即表現出吞噬作用）的百分比和每個(gè)細胞的平均熒光強度（也就是每個(gè)粒細胞吞噬的細菌數量）。
　　也測定了粒細胞的爆發(fā)性氧化能力，用來(lái)間接測定殺菌功能。肝素處理的血樣與大腸桿菌在３７℃孵育１０ｍｉｎ，然后加入二氫羅得明１２３（ＤＨＲ １２３），該物質(zhì)可與氧化爆發(fā)中生成的氧體系反應而產(chǎn)生熒光。用流式細胞儀測定熒光性粒細胞百分比（表現出爆發(fā)性氧化的細胞）和每個(gè)細胞中的熒光強度（每個(gè)粒細胞的爆發(fā)性氧化程度）。
統計分析
　　用ＷＩＮＤＯＷＳ版的ＳＡＳ軟件（８．１）進(jìn)行統計分析。所有變量的分布先進(jìn)行正態(tài)性檢驗。體質(zhì)指數ＢＭＩ、血清鐵蛋白濃度、白細胞分類(lèi)、ＰＨＡ和ＣｏｎＡ激發(fā)的淋巴細胞增殖反應數據經(jīng)對數轉換符合正態(tài)分布后進(jìn)行統計分析。
　　根據前面所述的鐵營(yíng)養狀況評價(jià)標準，５９名沒(méi)有炎癥和營(yíng)養缺乏的健康女性被分為兩組：鐵缺乏組（年齡７６．１±６．６，ｎ＝１２）和鐵充足組（年齡：７６．９±５．５，ｎ＝４７）。兩組女性間關(guān)于營(yíng)養狀況變量和炎癥檢測的數據差異性首先用Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ檢驗進(jìn)行判斷。用方差分析檢驗所有測定的免疫功能變量在兩組間的差異。所有分析的顯著(zhù)性水平設定為Ｐ＜０．０５。

結果

　　根據所用的篩選標準，認為所有進(jìn)入分析的對象是健康、沒(méi)有感染、一般營(yíng)養狀況良好的（表１）。鐵缺乏組和鐵充足組的營(yíng)養狀況和炎癥檢測的結果都在正常范圍，并且所有變量在兩組間沒(méi)有顯著(zhù)性差異（表１）。與預計的一樣，鐵缺乏組的鐵營(yíng)養狀況顯著(zhù)低于鐵充足組（表２）。鐵缺乏組所有機體鐵參數的值顯著(zhù)低于鐵充足組（Ｐ＜０．０５），即存儲鐵（較低的血清鐵蛋白）、組織鐵（增加的轉鐵蛋白受體）、轉運鐵（較低的血清鐵和轉鐵蛋白濃度）、和紅細胞鐵（較低的血紅蛋白和紅細胞容積）。大約一半的鐵缺乏對象處于貧血狀態(tài)，其余的處于紅細胞生成缺鐵期。兩組間的淋巴細胞總數和分類(lèi)（粒細胞和單核細胞）用絕對數量和百分比表示時(shí)沒(méi)有顯著(zhù)性差異（Ｐ＞０．１０沒(méi)有列出數據），兩組的這些數值均在正常范圍內下降，并且與以往報道的結果相似。不同濃度ＰＨＡ和ＣｏｎＡ激發(fā)的淋巴細胞增殖反應在鐵缺乏組女性中顯著(zhù)低于鐵充足組的女性（表３）。吞噬作用，即粒細胞吞入大腸桿菌的程度在兩種鐵營(yíng)養狀況下沒(méi)有顯著(zhù)差異。吞噬大腸桿菌、表現出呼吸爆發(fā)的粒細胞數，在鐵缺乏組和鐵充足組之間沒(méi)有顯著(zhù)性差異。但鐵缺乏組女性粒細胞表現出的呼吸爆發(fā)的幅度顯著(zhù)低于（２８％）鐵充足組的女性，可能提示鐵缺乏組的殺菌能力下降（表４）。

討論

　　在生化和細胞水平，鐵維持免疫反應中的作用被認為非常重要。例如，鐵是核糖核苷酸還原酶的組成部分，該酶涉及ＤＮＡ生成和細胞分裂；并且鐵對于中性粒細胞殺滅細菌過(guò)程中的髓過(guò)氧化物酶活性所必需。鐵對蛋白激酶Ｃ的活化也有重要作用，蛋白激酶Ｃ可以磷酸化各種調節細胞增殖的因子。有關(guān)人類(lèi)鐵缺乏與免疫失調的報告常常存在其他營(yíng)養素缺乏、亞臨床感染或炎癥等混雜因素，這會(huì )干擾鐵營(yíng)養狀況和免疫功能的檢測。很少研究在考慮了這些潛在的混雜因素后驗證鐵缺乏對免疫功能的作用，而且這樣研究的結果是混淆的。因此，我們周密地設計了研究，首先排除存在的混雜因素（炎癥和其他營(yíng)養素缺乏），然后檢驗免疫功能在鐵缺乏組和鐵充足組老年婦女之間的差異。我們沒(méi)有使用基于分離的單核細胞分析，而是采用了經(jīng)我們實(shí)驗室確認的全血分析。全血分析的好處在于用血量少，血樣制備簡(jiǎn)單，并與體內狀況最為接近。
　　我們考察老年群組的鐵營(yíng)養狀況和免疫反應的關(guān)系有幾個(gè)原因。鐵缺乏在居家或在養老機構居住的老人中非常普遍。再者，盡管這部分人群因為年齡關(guān)系，某些Ｔ細胞功能衰退，存在可能已經(jīng)使免疫系統受到損傷的事實(shí)，但還沒(méi)有關(guān)于老年人鐵營(yíng)養狀況和免疫力關(guān)系的研究。
　　大部分以往的研究提示鐵缺乏可能對自然免疫和Ｔ細胞介導功能比對體液免疫有更大影響；所以我們在本研究中著(zhù)眼于這些方面。鐵缺乏界定為存在儲存鐵耗竭和在包括組織鐵缺乏到貧血的全系列檢測中有兩項以上異常結果。
　　這項周密設計的橫斷面研究中，排除了疾病、炎癥、蛋白質(zhì)、維生素Ｂ１２、葉酸、鋅等可能影響免疫功能的關(guān)鍵營(yíng)養素缺乏等混雜因素，結果提示，鐵缺乏與細胞免疫和自然免疫的顯著(zhù)損害相關(guān)聯(lián)。
　　有趣的是在現在的研究中，淋巴細胞和分類(lèi)，粒細胞、單核細胞的絕對數量和百分比（數據未列出）在鐵缺乏組和鐵充足組之間沒(méi)有顯著(zhù)差異，與Ｔｈｉｂａｕｌｔ等的發(fā)現一致。而其他有報道提出鐵缺乏的兒童和成年人淋巴細胞計數減少。也有人報道在鐵缺乏貧血人群中存在Ｔ細胞或輔助Ｔ細胞減少。結果不同可部分解釋為研究中同時(shí)患有其他疾病、感染、其他營(yíng)養素缺乏等影響因素，或者測定淋巴細胞分類(lèi)的方法不同，或研究對象鐵缺乏的程度不同。
　　模仿體內Ｔ細胞對抗原的反應，將Ｔ淋巴細胞與有絲分裂原共同培養，其增殖能力在鐵缺乏組女性中顯著(zhù)降低，鐵缺乏組伴刀豆蛋白ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ激發(fā)的Ｔ細胞增殖是鐵充足組的３８％（２５ｍｇＬ）～４６％（３ｍｇＬ），同樣由植物血球凝集素ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ Ａ激發(fā)的Ｔ細胞增殖是鐵充足組的４２％（５ｍｇＬ）～６０％（１０ｍｇＬ）（表３）。Ｔ細胞對有絲分裂原反應增殖能力這樣大幅度的下降在以往鐵缺乏兒童和成人的研究中也有過(guò)報道；然而，這些人群可能也存在其他營(yíng)養素缺乏或亞臨床感染。有趣的是有兩項檢測了葉酸和維生素Ｂ１２的研究報道了相反的結果，這些研究還需要進(jìn)一步的討論。Ｋｕｌｐｏｎｇｓ等的研究中，樣本量較小，只有８名嚴重鐵缺乏但不缺葉酸和維生素Ｂ１２的泰國兒童，沒(méi)有觀(guān)察到他們存在ＰＨＡ激發(fā)的Ｔ細胞增殖反應下降。Ｇｒｏｓｓ等在非洲所進(jìn)行的研究中鐵缺乏人數也只有５人。這兩項研究人群中蛋白質(zhì)、鋅營(yíng)養狀況可能偏低，但沒(méi)有提供整個(gè)人群或對照人群關(guān)于這兩種營(yíng)養素營(yíng)養狀況的詳細資料，使他們的結果難以解釋。
　　考察過(guò)成人噬菌作用和殺菌作用的研究很少。本研究中，噬菌作用在鐵缺乏組和鐵充足組女性之間沒(méi)有顯著(zhù)差異：這與以往有關(guān)兒童的研究結果相一致。我們關(guān)于氧化爆發(fā)降低的發(fā)現也與在發(fā)展中國家兒童中做的調查結果相一致，但這些研究人群中也可能存在其他亞臨床營(yíng)養素的缺乏或感染。在Ｋｕｌｐｏｎｇｓ等的小樣本調查中，應用了更嚴格的設計以確保葉酸和維生素Ｂ１２充足，但沒(méi)有發(fā)現殺菌活性在鐵缺乏兒童（８名）和鐵充足兒童（２０名）間有顯著(zhù)差異。蛋白質(zhì)和鋅營(yíng)養狀況可能是這些研究中的混雜因素，但這些作者沒(méi)有提供有關(guān)的詳細資料。我們的研究結果提示了粒細胞呼吸爆發(fā)能降低可能使鐵缺乏老年人增加感染的風(fēng)險。這種推測與我們在斯里蘭卡兒童中進(jìn)行的隨機對照研究結果相一致，通過(guò)補鐵提高鐵營(yíng)養水平，使得上呼吸道感染的發(fā)病率降低，病程縮短。
　　本研究的說(shuō)服力在于：設計中排除了存在疾病、炎癥和潛在營(yíng)養素不足的對象（例如營(yíng)養不良和缺乏蛋白質(zhì)、維生素Ｂ１２、葉酸或鋅），根據缺鐵各階段的指標檢查對鐵營(yíng)養狀況進(jìn)行了全面評價(jià)，對細胞介導免疫和自然免疫的全面評價(jià)。但因為本研究是橫斷面調查的性質(zhì)，只能說(shuō)明事物間的相關(guān)性。要確定鐵缺乏和免疫反應之間是否存在因果關(guān)系還需要進(jìn)一步的實(shí)驗研究。而且，鐵缺乏的原因，包括膳食攝入、胃酸缺乏，和出血等情況應該在進(jìn)一步的調查中考查。我們正在進(jìn)行一項研究，調查補充鐵劑對鐵缺乏老年女性免疫功能的作用。
　　總之，用嚴格標準保證研究對象不存在潛在疾病、感染、炎癥和可能影響免疫功能的關(guān)鍵營(yíng)養素缺乏，本次橫斷面調查表明老年女性鐵營(yíng)養狀況不良與自然免疫和細胞免疫ＣＭＩ檢測指標的下降存在明確的相關(guān)關(guān)系。這些發(fā)現有公共衛生意義，而且強調了診斷、治療、預防鐵缺乏的重要性。本研究提示鐵缺乏人群免疫功能下降，可能增加感染的流行。用類(lèi)似的嚴格的研究對象篩選程序做進(jìn)一步的實(shí)驗性研究，應該同時(shí)考察鐵營(yíng)養狀況與免疫功能和感染的關(guān)系。

　　譯自：Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００４ ７９５１６－５２１