楊 紅 楊 毅 王衛平(上海醫科大學(xué)兒科醫院兒保科及兒研所，上海 ２０００３２)
　　摘要：目的 研究視黃酸（ＲＡ）促進(jìn)臍血淋巴細胞（ＣＢＬ）細胞因子表達的作用途徑，探討視黃酸受體α在該過(guò)程中的可能作用。方法 收集１９例健康新生兒的臍血標本進(jìn)行體外培養，采用ＲＴＰＣＲ法檢測ＣＢＬ中視黃酸受體α（ＲＡＲα）、ＩＬ２、ＩＦＮγ和ＩＬ４的ｍＲＮＡ水平。結果 ＲＡ上調ＣＢＬ中ＲＡＲα的基因表達水平，培養２４ｈ時(shí)的上調幅度為（１．１７±０．０７）倍（Ｐ＜０．００１）。ＲＡ上調ＩＬ２的基因表達水平，培養２４ｈ時(shí)的上調幅度為（１．２９±０．２０）倍Ｐ＜０．００１）。ＲＡ也上調ＩＦＮγ的基因表達水平，培養４８ｈ時(shí)的上調幅度為（１．３９±０．２６）倍Ｐ＜０．００１）。ＲＡ還上調ＩＬ４的基因表達水平，培養２４ｈ時(shí)的上調幅度為（１．５２±０．４４）倍Ｐ＜０．００２）。ＲＡ使ＲＡＲα基因表達的上調幅度與ＲＡ使ＩＬ２、ＩＦＮγ和ＩＬ４基因表達的上調幅度皆存在正相關(guān)，ｒ 值分別為０．４０、０．３９和０．４６Ｐ＜０．０５。結論 ＲＡＲα可能參與ＲＡ對ＣＢＬ細胞因子（ＩＬ２、ＩＦＮγ和ＩＬ４）表達的促進(jìn)作用。ＲＡ可能通過(guò)增加ＲＡＲα的表達而上調ＩＬ２、ＩＦＮγ及ＩＬ４等細胞因子的表達，從而促進(jìn)ＣＢＬ的功能。
關(guān)鍵詞：視黃酸受體；基因表達；胎血；淋巴細胞；細胞活素類(lèi)

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｐａｔｈ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ＲＡｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓＣＢＬ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎｉｎｅｔｅｅｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓａｎｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｎｅｗｂｏｒｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ＣＢＬ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｒｅｔｏｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒαＲＡＲα，ＩＬ２，ＩＦＮγ ａｎｄ ＩＬ４ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎＲＴＰＣＲ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＲＡＲα ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｗａｓ１．１７±０．０７ｔｉｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓ（Ｐ＜０．００１）． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ２ ｗａｓ ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ ＲＡ，ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｗａｓ（１．２９±０．２０）ｔｉｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓＰ＜０．００１）． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮγ ｗａｓ ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ ＲＡ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｗａｓ（１．３９±０．２６）ｔｉｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ４８ ｈｏｕｒｓＰ＜０．００１）． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ４ ｗａｓ ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ ＲＡ，ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｗａｓ（１．５２±０．４４）ｔｉｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓＰ＜０．００２）． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｆ ＲＡＲα ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅｓ ｏｆ ＩＬ２、ＩＦＮγ ａｎｄ ＩＬ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ，ｒ＝０．４０ ０．３９ ０．４６ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＰ＜０．０５． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＲＡＲα ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｉｖｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ＣＢＬ ｂｙ ＲＡ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｆｅｔａｌ ｂｌｏｏｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ

許多研究表明類(lèi)維生素Ａ能夠促進(jìn)免疫細胞的功能１， 但其作用途徑和機制有待進(jìn)一步闡明。這些年細胞因子的作用日益受到重視，本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＲＴＰＣＲ）技術(shù)，檢測類(lèi)維生素Ａ代表分子——視黃酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ，ＲＡ）對臍血淋巴細胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＣＢＬ）中視黃酸受體α（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒα， ＲＡＲα）和一些細胞因子基因表達水平的調節，以探討ＲＡ對臍血淋巴細胞細胞因子表達的促進(jìn)作用是否通過(guò)ＲＡＲα調節的途徑。

１ 材料與方法

１．１ 淋巴細胞體外培養
臍血獲自上海市金山區金衛鄉衛生院母嬰健康的順產(chǎn)新生兒，分離單核細胞后，用ＲＰＭＩ１６４０培養液（ＧＩＢＣＯ產(chǎn)品）懸浮細胞為１０６ｍｌ，培養在９６孔Ｕ型板中，加入ＰＨＡ（上海市醫學(xué)化驗研究所產(chǎn)品），深度為５０ｍｇＬ；視黃酸（ＲＡ，Ｓｉｇｍａ公司產(chǎn)品），濃度為１×１０－６ｍｏｌＬ 在培養６、２４、４８和７２ｈ后分別收獲細胞，留置未培養的單核細胞作為對照。
１．２ ＲＴＰＣＲ檢測ＲＡＲα、ＩＬ２、ＩＦＮγ和ＩＬ４ｍＲＮＡ
１） 總ＲＮＡ抽提 培養前后的臍血淋巴細胞采用ＴＲＩｚｏ１試劑（ＧＩＢＣＯ產(chǎn)品）提取制備總ＲＮＡ，用紫外分光光度計（日本島津ＵＶ１６０１）測定Ａ ２６０進(jìn)行準確定量。
２） 引物設計 參考國外文獻并采用計算機輔助設計，引物由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所合成。
３）ＲＴＰＣＲ 取１μｇ總ＲＮＡ經(jīng)逆轉錄酶（ＧＩＢＣＯ產(chǎn)品）催化合成ｃＤＮＡ第１鏈，并以此為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴增，取擴增產(chǎn)物１０μｌ瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀(guān)察結果并照相（英國ＵＶＰ公司紫外凝膠成像及分析儀）。
１．３ 結果分析與顯著(zhù)性檢驗
采用紫外凝膠成像及分析系統（英國ＵＶＰ公司）對電泳凝膠中的ＰＣＲ產(chǎn)物條帶進(jìn)行定量分析。配對資料比較的顯著(zhù)性檢驗采用配對 ｔ 檢驗，直線(xiàn)相關(guān)系統的顯著(zhù)性檢驗根據 ｒ 值直接查 ｒ 界值表。

２ 結果

２．１ ＲＡ對體外培養的ＣＢＬ中ＲＡＲα基因表達的調節
ＣＢＬ在ＰＨＡ刺激下，ＲＡＲ基因表達水平很快升高，２４ｈ達高峰。加入ＲＡ共同培養后即觀(guān)察到ＲＡ對ＲＡＲα表達的顯著(zhù)上調。培養２４ｈ時(shí)上調幅度為（１．１７±０．０７）倍ｔ＝４．８４８ Ｐ＜０．００１。
２．２ ＣＢＬ中細胞因子基因表達的調節及其與ＲＡＲα
ｍＲＮＡ水平變化的相關(guān)性
ＣＢＬ在ＰＨＡ刺激下，ＩＬ２基因表達水平很快升高，２４ｈ達到高峰。加入ＲＡ共同培養后即出現ＲＡ對ＩＬ２表達的顯著(zhù)上調，培養２４ｈ時(shí)的上調幅度為（１．２９±０．２０）倍ｔ＝５．４８３ Ｐ＜０．００１。分析ＲＡ使ＲＡＲα基因表達的上調幅度與ＲＡ使ＩＬ２基因表達的上調幅度發(fā)現存在正相關(guān)關(guān)系ｒ＝０．４０ Ｐ＜０．０５圖１。

ＣＢＬ在ＰＨＡ刺激下，ＩＦＮγ基因表達水平逐步升高，４８ｈ達到高峰。加入ＲＡ共同培養后即出現ＲＡ對ＩＦＮγ基因表達的顯著(zhù)上調，培養４８ｈ時(shí)的上調幅度為（１．３９±０．２６）倍ｔ＝４．６８８ Ｐ＜０．００１。分析ＲＡ使ＲＡＲα基因表達的上調幅度與ＲＡ使ＩＦＮγ基因表達的上調幅度發(fā)現存在正相關(guān)關(guān)系ｒ＝０．３９ Ｐ＜０．０５圖２。

ＣＢＬ在ＰＨＡ刺激后，ＩＬ４基因表達水平很快升高，２４ｈ達到高峰。加入ＲＡ共同培養后即出現ＲＡ對ＩＬ４表達的顯著(zhù)上調，培養２４ｈ時(shí)的上調幅度為（１．５２±０．４４）倍ｔ＝３．７７０ Ｐ＜０．００２。分析ＲＡ使ＲＡＲα基因表達的上調幅度與ＲＡ使ＩＬ４基因表達的上調幅度發(fā)現存在正相關(guān)關(guān)系ｒ＝０．４６ Ｐ＜０．０５圖３。

３ 討論

許多研究表明類(lèi)維生素Ａ是一類(lèi)重要的免疫功能調節劑，對Ｔ、Ｂ淋巴細胞的活化、增殖和分化具有重要的調節作用１。在類(lèi)維生素Ａ促進(jìn)Ｔ、Ｂ淋巴細胞功能的機制研究中，細胞因子的作用日益受到重要。已發(fā)現受類(lèi)維生素Ａ調節表達的細胞因子包括ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ１、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＦＮγ、ＴＧＦβ及ＴＮＦα等２５。
細胞因子參與免疫應答的全過(guò)程，在參與免疫應答的Ｔ、Ｂ等淋巴細胞間進(jìn)行信息傳遞。ＴＨ１類(lèi)細胞因子（ＩＬ２、ＩＦＮγ等）和ＴＨ２類(lèi)細胞因子（ＩＬ４）等對Ｔ、Ｂ細胞功能具有重要的調節作用。本研究表明ＲＡ使體外活化ＣＢＬ中ＩＬ２、ＩＦＮγ及ＩＬ４的ｍＲＮＡ表達水平明顯升高，揭示ＲＡ能夠通過(guò)上調ＴＨ１、ＴＨ２類(lèi)細胞因子的表達，從而促進(jìn)ＣＢＬ的功能。但是ＲＡ通過(guò)何種途徑調節細胞因子的表達，尚有待闡明。１９８７年視黃酸受體（ＲＡＲｓ）的發(fā)現６，大大促進(jìn)并深化了對維生素Ａ增強免疫功能的機制研究。視黃酸受體屬于類(lèi)固醇甲狀腺激素核內受體超家族成員，包括３種亞型：ＲＡＲα、ＲＡＲβ和ＲＡＲγ。其中ＲＡＲα在細胞中的表達最為廣泛。近幾年來(lái)，我們既往的研究發(fā)現７人外周血淋巴細胞中主要表達ＲＡＲα，且ＲＡＲα基因的轉錄表達受線(xiàn)裂原和ＲＡ的調節。本研究再次表明ＲＡ上調ＰＨＡ活化ＣＢＬ中ＲＡＲα基因表達水平，提示ＲＡＲα可能參與ＲＡ對淋巴細胞的調節功能。ＲＡＲα是類(lèi)維生素Ａ依賴(lài)的轉錄因子，位于細胞核內基因轉錄的調控區，受其調節的基因有５０余種，包括ＲＡＲβ、層粘蛋白Ｂ１和垂體生長(cháng)激素等基因８。本研究發(fā)現，ＲＡ上調ＲＡＲα基因表達幅度與ＲＡ上調ＩＬ２、ＩＦＮγ及ＩＬ４基因表達幅度間皆存在正的相關(guān)關(guān)系，提示ＲＡＲα可能參與ＲＡ對ＣＢＬ細胞因子表達的促進(jìn)作用。ＲＡ可能通過(guò)增加ＲＡＲα的表達而上調ＩＬ２、ＩＦＮγ及ＩＬ４等細胞因子的表達，從而促進(jìn)ＣＢＬ的功能。
兒童的維生素Ａ營(yíng)養水平與其免疫功能的關(guān)系日益受到臨床醫生的重視，研究表明適量維生素Ａ營(yíng)養能夠促進(jìn)兒童免疫系統的發(fā)育和功能。進(jìn)一步闡明維生素Ａ促進(jìn)Ｔ、Ｂ淋巴細胞功能的作用機制，將為在兒童中開(kāi)展維生素Ａ補充干預試驗提供理論和實(shí)驗依據，也能為治療其他免疫缺陷病提供新的途徑。

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