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黃 玥 王 勁(Ｈ．Ｍ． Ｐａｔｅｌ Ｓ．Ｓ． Ｐａｎｄｉｅｌｌａ Ｒ．Ｈ． Ｗａｎｇ Ｃ． Ｗｅｂｂ)
摘要：根據乳酸桿菌發(fā)酵谷類(lèi)底物的能力和耐受模擬胃轉運的能力，選出３種乳酸桿菌株，測定它們的膽汁耐量。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＣＩＭＢ １１９５ Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＩＭＢ ８８２１ 和 Ｌ． ＰｌａｎｔａｒｕｍＮＣＩＭＢ ８８２６ 在ｐＨ ７的磷酸鹽緩沖液中暴露于２％ 的膽汁４ ｈ。同時(shí)還測定了添加谷類(lèi)提取物、升高的糖濃度及游離氨基氮（ＦＡＮ）濃度等的效應。在無(wú)任何添加物的環(huán)境中，Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ表現出對膽汁最大的抵抗性，而Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ顯示最大的敏感性。 添加谷類(lèi)提取物會(huì )提高所有３種乳酸桿菌株的膽汁耐受力，大麥小麥提取物提高乳酸桿菌活力相當，而麥芽提取物表現出更大的增強效應。提高的程度和谷類(lèi)中的可溶性糖和ＦＡＮ濃度有關(guān)。這一點(diǎn)通過(guò)在培養基中添加糖，隨著(zhù)糖濃度的升高菌體的活力也逐步提高而得到進(jìn)一步證實(shí)。游離氨基氮也能提高細菌對膽汁的抵抗，但影響程度弱于糖及谷類(lèi)提取物。
關(guān)鍵詞：麥芽；小麥；大麥；乳酸菌；提取物
１ 簡(jiǎn)介
益生菌食物（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｆｏｏｄｓ）是膳食補充劑，包含一種或多種微生物，這些微生物有益于改善食用者的腸道微生物的平衡。許多營(yíng)養與治療效應得益于益生菌，包括乳糖代謝、控制胃腸道感染、抑制癌癥、降低血清膽固醇、免疫刺激和提高食物消化率等。益生菌的治療功能由許多因素決定，但最重要的是食品生產(chǎn)、儲存、通過(guò)胃腸道轉運時(shí)細菌的存活力和細菌在大腸中的繁殖能力。選擇合適的菌株必須考慮這些因素。
益生菌通過(guò)食道面臨的主要的挑戰是胃分泌的胃酸及釋放到十二指腸的膽鹽。許多研究者研究了在膽鹽和低ｐＨ環(huán)境中微生物的存活力，并明確了益生菌在體內和體外的存活力與其借以運輸的食物載體的種類(lèi)有很大影響。緩沖能力、ｐＨ及食物載體的物理化學(xué)特性都是重要因素。
益生菌的載體食物通常是發(fā)酵食物，當然，也可以是果汁飲料、甜牛奶、嬰兒食品及糖果等。在發(fā)酵的益生菌產(chǎn)品中，益生微生物必須能使產(chǎn)品具有良好的感官特性，因為這個(gè)原因，使用益生菌作為基底培養菌時(shí)通常結合使用其他適合產(chǎn)品特性的微生物。例如，益生菌酸乳酪常在生產(chǎn)時(shí)添加嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌以達到理想的感官特性。
本研究是評估谷類(lèi)作為開(kāi)發(fā)益生菌產(chǎn)品底物可能性的項目里的分課題。谷類(lèi)對于益生菌株的生長(cháng)來(lái)說(shuō)是很好的基底物，這是由于谷類(lèi)基質(zhì)中含有不能被消化的益生元成分。然而，由于谷物的多樣性，因而需要一種系統的方法來(lái)確定哪些因素可能提高益生菌株在體內和體外的生長(cháng)和存活。
以前本實(shí)驗室的實(shí)驗研究集中于研究人源性的乳酸桿菌株對模擬胃酸的抵抗能力，和谷類(lèi)提取物（麥芽，小麥，大麥）及它們的成分（葡萄糖，麥芽糖和游離氨基氮）提高酸耐受的能力等。結果顯示，麥芽、小麥、大麥提取物在酸性條件下對乳酸桿菌生物活性有很明顯的保護效應，進(jìn)一步研究揭示，這種效應主要歸功于谷類(lèi)的糖含量多少。本研究旨在評價(jià)３種菌株對已知人體小腸中最高膽汁酸鹽濃度的膽汁耐受力，同時(shí)研究了谷類(lèi)基底物及其成分對這些菌株的膽汁耐受的影響。
２ 材料和方法
２．１ 原料和培養物的保存
根據發(fā)酵谷物基底物的能力和在低ｐＨ環(huán)境下的存活力，選擇本次研究所用的３種菌株，菌株來(lái)源于“國家工業(yè)與海洋細菌收藏中心”（ＮＣＩＭＢＡｂｅｒｄｅｅｎＳｃｏｔｌａｎｄ。它們是：Ｌ． ＲｅｕｔｅｒｉＮＣＩＭＢ １１９５，分離自人體腸道，Ｌ． ＰｌａｎｔａｒｕｍＮＣＩＭＢ ８８２６ 分離自人體唾液和Ｌ． ＡｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＮＣＩＭＢ ８８２１，同樣分離自人體唾液。儲備培養物維持在４℃的ＭＲＳ瓊脂培養基ＯｘｏｉｄＢａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ ＵＫ中，并每月傳代培養。操作培養物保存在ＭＲＳ肉湯Ｏｘｏｉｄ中。
２．２ 制備清洗的細胞懸浮液
乳酸桿菌培養物在３７℃的ＭＲＳ肉湯中過(guò)夜生長(cháng)后進(jìn)一步轉移至新鮮ＭＲＳ中１６ｈ，然后離心４５００ｇ１０ｍｉｎ，接著(zhù)以１４濃度的Ｒｉｎｇｅｒｓ液Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ清洗一次，然后重懸至 Ｒｉｎｇｅｒｓ液中，并配至與原始培養物體積相同。
２．３ 谷物提取物的制備
使用一個(gè)帶有０．５ｍｍ濾網(wǎng)的磨粉機Ｐｅｒｔｅｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＳｗｅｄｅｎ將麥芽、小麥、大麥磨成粉。然后混懸于自來(lái)水中２０％，ｗｗ，室溫下輕柔混勻１５ｍｉｎ。再將此糊漿離心（６０００ｇ，３０ｍｉｎ）后，倒出上清液，調ｐＨ至７．２０５ｍｏｌ ＨＣｌ，然后高壓滅菌１２１℃，１５ｍｉｎ。
２．４ 膽汁，葡萄糖和酵母提取物溶液的制備
３％和６％的牛膽汁溶液Ｏｘｏｉｄ在磷酸鹽緩沖液Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ ９ｇＬ ＮａＣｌ ９ｇＬ ＫＨ２ＰＯ４ １．５ｇＬ 中制備，酵母提取物儲備液Ｏｘｏｉｄ配制成２、４．５、６和９ｇＬ的濃度備用，葡萄糖Ｏｘｏｉｄ溶液配制成２、５、１０、１５、２０和２５ｇＬ濃度備用。所有３種溶液調節到ｐＨ ７．００后，用上述方法高壓滅菌。
２．５ 乳酸桿菌膽汁鹽抵抗力的測定
將６％牛膽汁溶液５ｍｌ分別移至一系列１５ｍｌ的離心管中，再往離心管內分別加入５ｍｌ麥芽、大麥及小麥的提取物，然后加入５ｍｌ細胞懸浮液，在３７℃下孵育。反應體系最后的膽汁濃度是２％、ｐＨ為７．００±０．１０。在暴露０、１、２、３和４ｈ后，用Ｒｉｎｇｅｒｓ溶液分別稀釋?zhuān)保氨逗螅戒佊冢停遥迎傊希茫停椋欤澹螵玻停椋螅颍岱椒▽盍嫈怠Ｆ桨逶冢常贰嫦路跤矗福瑁锘盍Γǎ觯椋幔猓椋欤椋簦┮裕欤铮纾保埃煟悖妫酢Nｍｌ計算。
葡萄糖和酵母提取物的效應也使用上面的方法，只是以５ｍｌ的葡萄糖溶液２．００～２５．００ｇＬ或酵母提取物０．６０～３．００ｇＬ，相當于ＦＡＮ濃度１３～４８ｍｇＬ代替谷類(lèi)提取物。對照組實(shí)驗使用３％的膽汁溶液（也就是反應體系中最后的濃度為１％）來(lái)重復進(jìn)行。
本實(shí)驗添加了谷類(lèi)提取物、葡萄糖和酵母提取物，使用２％的膽汁濃度是因為考慮到Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ和Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍｗａｓ這兩種菌株在１％濃度時(shí)已有很明顯的抵抗，那么在更高濃度的膽汁中添加物的效應會(huì )因為有更多細胞數量的減少而更易于測定。
２．６ 化學(xué)分析
可溶性糖總量使用硫酚法１，ＦＡＮ含量使用 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ’ｓ 法２，二者均通過(guò)比色法測量。
３ 結果和討論
膽鹽由初級膽汁酸在肝臟中由膽固醇合成。在分泌到小腸腔內之前，它們和甘氨酸，牛磺酸，硫酸鹽，葡萄糖醛酸或葡萄糖結合。雖然牛磺酸／甘氨酸的比例在不同個(gè)體及不同膳食人群中變化很大，但與乙二醇和牛磺酸結合的膽汁酸是人體主要的膽汁酸。進(jìn)入小腸上部，它們脂肪的消化和吸收。 這對于微生物體來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵的，因為它們的細胞膜是由脂質(zhì)和脂肪酸構成的，并且一般認為細胞的死亡是由分解所致。 還有一種觀(guān)點(diǎn)認為膽汁酸鹽象有機酸一樣，通過(guò)酸化細胞質(zhì)而影響它的毒性，即弱酸能以其分子形式通過(guò)被動(dòng)擴散進(jìn)入細胞，然后在細胞質(zhì)中釋放出氫離子。乳酸桿菌和其他許多生物體一樣，Ｈ＋ＡＴＰ酶消耗ＡＴＰ的能量，排出的質(zhì)子來(lái)調節其胞質(zhì)中的ｐＨ值。通過(guò)比較乙酰脫氧膽酸ＧＤＣＡ、乙酰膽酸ＧＣＡ、牛磺鵝脫氧膽酸ＴＤＣＡ、牛磺鵝膽酸ＴＣＡ、膽汁酸ＣＡ和脫氧膽酸ＤＣＡ等對細胞的影響以及監測膽鹽水解酶ＢＳＨ活力的影響后，許多研究者指出細胞內的酸化可能是細胞在富膽汁溶液中死亡的主要原因。ＢＳＨ能水解連接膽汁酸的肽鏈，這種酶在許多腸道細菌中能發(fā)現，它們分屬于廣泛的細菌種屬，例如乳酸桿菌、鏈球菌屬、雙歧桿菌、腸球菌、擬桿菌屬和梭菌屬等。Ｄｅ Ｓｍｅｔ等揭示ＧＣＤＡ比ＴＤＣＡ對乳酸桿菌的毒性更大而且在低ｐＨ值環(huán)境中膽鹽的毒性更大。ＢＳＨ活力和耐受力之間的關(guān)系揭示出這種酶可能是提高對膽鹽抵抗力的原因。ＧＤＣＡ比ＴＤＣＡ具有更高毒性被認為是和它們不同的分解產(chǎn)物有關(guān)，ＧＤＣＡ和ＴＤＣＡ的ｐＫａ值分別是３．９和１。由于ＴＤＣＡ是種強酸，這種化合物幾乎全部以其解離形式存在接近中性ｐＨ環(huán)境中，因此其以非解離形式進(jìn)入并酸化細胞的數量可以忽略不計。而由于ＧＤＣＡ是種很弱的酸，相對而言其質(zhì)子化存在形式的數量較大，它能夠進(jìn)入細胞并降低細胞內的ｐＨ。能表達ＢＳＨ酶的菌株，表現出能將質(zhì)子化的ＧＤＣＡ轉換為游離的ＤＣＡ的能力這是一種更弱的酸ｐＫａ ５。理論上，弱酸然后能重新捕獲結合傳輸的質(zhì)子并且通過(guò)被動(dòng)擴散將其傳遞出細胞，因此能避免酸化。因此，不具有ＢＳＨ活性的菌株必須額外消耗 ＡＴＰ通過(guò)Ｈ＋ＡＴＰ酶來(lái)維持其內部的ｐＨ。
其他研究者觀(guān)察到在沒(méi)有其他營(yíng)養素的情況下，膽汁的毒性是直接和ＢＳＨ活力成比例的。這可能是由于相對于結合膽鹽，ＢＳＨ形成的游離膽鹽具有更大的毒性。雖然次級膽鹽是非常弱的酸，不能降低細胞質(zhì)的ｐＨ，但它們能通過(guò)其更高的疏水性來(lái)裂解細胞膜，從而破壞細菌的細胞。雖然ＢＳＨ活力是用來(lái)降低膽汁的毒性效應的，但是有一個(gè)問(wèn)題出現了，即為什么在細菌受到更大的抑制時(shí)會(huì )產(chǎn)生活性。答案可能就是在適度的酸性環(huán)境里（比如小腸），ＢＳＨ陽(yáng)性細胞可能得益于脫羥基膽汁的細菌。脫羥基膽酸在酸性溶液里溶解性降低并沉淀，因而其生物活性降低。由于營(yíng)養素的利用率能降低游離膽鹽的毒性，因此另一種可能是在某些腸道微生物體內存在第二種尚未被發(fā)現的依賴(lài)ＡＴＰ的非結合膽汁解毒步驟。
本次研究在２％的牛膽汁中，Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ是最敏感的菌株，其活菌菌落減少了２．８５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ其次，活性減少了１．９４ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ， 而最耐受菌株是Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ，僅降低了１．１３ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ表１。
在添加了谷類(lèi)后，Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ的耐量顯著(zhù)提高，提高量分別是：添加麥芽為２．４６ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，添加小麥和大麥為２．４５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ和２．４０ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。在Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ和Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ中添加谷類(lèi)也能提高其耐量，只是提高的程度很微弱。麥芽提取物再次顯示出最大的效應，能提高活性分別至１．６５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ和１．００ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。然而小麥和大麥降低Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞死亡至１．３４ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ和１．２６ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ至０．７５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ和０．８１ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。很明顯對于每一種菌株，對膽鹽抵抗力的提高取決于所使用的谷類(lèi)提取物。
通過(guò)表２，我們看到麥芽、小麥和大麥增強抵抗膽鹽的保護效應都和化學(xué)成分是直接相關(guān)的。小麥和大麥的提取物包含相當于麥芽１３的總糖含量（分別為４．７６和４．５４ｇＬ，麥芽為１１．２１ｇＬ）和大約１３的ＦＡＮ含量１９．４５、１７．１１以及５７．１２ｍｇＬ。這是由于淀粉分解酶和蛋白水解酶的活性，它們能對麥芽制作過(guò)程中谷物中的淀粉和蛋白質(zhì)起水解作用。相對小麥和大麥，升高的游離氨基氮含量能提高麥芽提取物的緩沖力。
為了研究添加谷物后膽汁耐量的提高是由于哪種成分，分別使用葡萄糖和酵母提取物研究各自的作用。圖１中顯示了隨著(zhù)葡萄糖濃度的升高，暴露２％的膽汁４ｈ后，葡萄糖對于菌株生物活性的影響。對于全部的菌株都觀(guān)察到，隨著(zhù)葡萄糖濃度的升高對膽汁酸的抵抗也逐步加強，支持了Ｄｅ Ｓｍｅｔ等的假設。
正如我們初期的實(shí)驗一樣，Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ再次表現為最具抵抗力的菌株。往反應體系中加入８．３３ｇＬ的葡萄糖造成大約０．３５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ細胞減少，這和加入小麥和大麥提取物后所觀(guān)察到的水平差不多，但比麥芽高一些。在僅有膽鹽存在時(shí)，Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ比Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ耐受量大得多，然而當僅加入０．６７ｇＬ葡萄糖時(shí)，膽汁的殺菌作用對Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ的活性有較大下降，由２．８５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ降至１．７５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，然而Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ的活性則沒(méi)影響。 雖然在僅有膽汁存在時(shí)Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ表現出最大的敏感性，但在各濃度中，當反應體系中有葡萄糖時(shí)，Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ比Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ更具抵抗性。在最高葡萄糖濃度時(shí)，Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ的細胞計數降到０．８８ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，說(shuō)明改善了１．０６ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ的細胞數減為０．６１ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，即改善了１．２ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。和對照組相比，每種菌株具有統計學(xué)意義上生物活性提高的閾值在不同葡萄糖濃度下是不同的。Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ直到５ｇＬ葡萄糖濃度時(shí)才觀(guān)察到生物活性的改善，而Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ和Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ分別為０．６７ｇＬ和１．６７ｇＬ。
由于Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ和Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ對膽汁的敏感性最大，所以使用這兩種菌株來(lái)研究ＦＡＮ對膽汁耐量的影響。在有葡萄糖存在時(shí)，細胞的生物活性隨著(zhù)ＦＡＮ含量的提高而逐步提高。這可再次由Ｄｅ Ｓｍｅｔ等提出的理論來(lái)解釋?zhuān)驗槿樗釛U菌能利用氨基酸作為可發(fā)酵的碳源產(chǎn)生ＡＴＰ。在４８ｍｇＬ的ＦＡＮ濃度下，Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ和Ｌ．Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ細胞死亡分別降至０．５６ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ和１．２７ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。因為葡萄糖存在時(shí)，Ｌ．Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ的膽汁耐量改善最多。酵母提取物的保護效應比相同濃度的葡萄糖要低，這提示著(zhù)提高體內膽汁耐量，碳水化合物比ＦＡＮ可能更重要。以前的研究者發(fā)現食物成分在胃腸道轉運時(shí)，由于具有食物成分的緩沖能力也能提高菌株的存活力 由于ＦＡＮ能提供一定的緩沖能力因而谷物必定也是如此，然而，在我們的研究中，由于將所有反應體系的都調整到ｐＨ７的環(huán)境中因而沒(méi)有對緩沖能力的效應的進(jìn)行觀(guān)察。
已有許多實(shí)驗研究了膽汁對不同種類(lèi)細菌的影響；然而，對于食品或食物成分這類(lèi)可能具有保護效應的因素的研究卻很少。我們的研究結果提示，可發(fā)酵的碳源是減輕膽汁有害效應的關(guān)鍵所在，這和其他研究者的結果一致。對ＢＳＨ活性的雙歧桿菌屬的實(shí)驗研究發(fā)現，相對單糖組分而言，低聚糖能提高抵抗膽汁的殺菌作用。這也支持了我們的實(shí)驗結果，說(shuō)明谷類(lèi)提取物，尤其是麥芽提取物比僅存在葡萄糖時(shí)發(fā)揮更強的保護效應。這可能是由于非還原的蔗糖和可溶性的低聚糖存在的結果，它們能通過(guò)和葡萄糖相似的途徑來(lái)提高對膽汁耐量。當然ＦＡＮ和還原糖聯(lián)合存在時(shí)也能提高乳桿菌屬的膽汁耐量。盡管明確了可溶性糖對于乳酸桿菌在體外的膽汁耐受很重要，但是這些成分在體內卻不能發(fā)揮保護效應，因為它們在小腸中很快就被吸收了。而谷類(lèi)含有大量的不能被消化的碳水化合物，比如抗性淀粉、β葡聚糖、水蘇糖、棉子糖、果糖低聚糖等，都表現出了膽汁的保護效應。
雖然對于所有菌株而言，加入葡萄糖和谷類(lèi)都能提高它們的膽汁耐量，但是各菌株之間觀(guān)察到若干差異。２％膽汁中，加入麥芽提取物，Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ比Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ具有更大膽汁耐量，但若加入小麥、大麥或者葡萄糖等，則具有相反結果。這提示著(zhù)在選擇益生菌株時(shí)，營(yíng)養素的選擇和菌株的選擇一樣關(guān)鍵。
對于ＢＳＨ活力特定部位和膽汁耐量的研究發(fā)現，從幾乎腸道分離的細菌都具有ＢＳＨ活力。同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了腸道分離的細菌比從體內其他部位或食物中分離的細菌對膽鹽更具耐受性。我們的研究也證實(shí)了這點(diǎn)，在任何測試環(huán)境下，由腸道分離的Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ比從唾液分離的Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ和Ｌ．Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ對膽汁更為耐受。
本研究結果的結論是，麥芽、小麥、大麥提取物通過(guò)減少膽鹽的毒性，而對Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ，Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ和Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ等起保護作用。由于谷類(lèi)中的個(gè)別組分具有這些有益效應，所以谷類(lèi)的成分與這種保護效應有關(guān)。
部分參考文獻：
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譯自：Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００４ ２１ ８３－８９ | 