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周小建１ 王衛平２ 楊 毅２ １ 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫院兒內科，上海 ２０００８０,２ 復旦大學(xué)兒科醫院，上海 ２０００３２)
摘要：目的 維生素Ａ缺乏仍是發(fā)展中國家兒童的常見(jiàn)病嚴重威脅兒童的健康。給予足量的維生素Ａ可有效預防感染性疾病并降低死亡率，這種作用可能與維生素Ａ及其活性代謝產(chǎn)物視黃酸ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ＲＡ的免疫調節作用有關(guān)。維生素Ａ對免疫系統的影響正日益被人們所關(guān)注。本研究通過(guò)檢測胸腺細胞發(fā)育過(guò)程中Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表達變化，并觀(guān)察視黃酸對其表達的影響，初步探討Ｎｏｔｃｈ１信號途徑在視黃酸對胸腺細胞分化發(fā)育中的作用。方法 采用胸腺組織體外培養的方法，在培養中加入視黃酸受體活化劑－全反式視黃酸ａｔＲＡ或視黃酸受體拮抗劑－Ｒｏ４１ ５２５３。在培養的不同時(shí)間收集Ｔ細胞，用熒光標記的抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８抗體染色，應用流式細胞儀進(jìn)行分析，觀(guān)察胸腺細胞成熟分化表面標志的變化。實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ檢測培養過(guò)程中Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表達變化。結果 采用流式細胞儀分析視黃酸受體的活化與阻抑對胸腺細胞成熟分化的影響，結果顯示，在加入ＲＡ激活視黃酸受體后 ２４ｈ，ＣＤ４＋胸腺細胞明顯增加，與對照組相比差異顯著(zhù)Ｐ＜０．０５。胸腺細胞表達Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ，實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ結果顯示，在ａｔＲＡ作用下，胸腺細胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表達在培養２４ｈ即明顯下降，與ＣＤ＋胸腺細胞的變化負相關(guān)。結論 視黃酸能下調胸腺細胞表達Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ，Ｎｏｔｃｈ１信號途徑可能參與了視黃酸對胸腺細胞發(fā)育的調節作用。
關(guān)鍵詞：視黃酸；受體；胸腺細胞； Ｎｏｔｃｈ１；基因
維生素Ａ缺乏癥仍是發(fā)展中國家兒童的常見(jiàn)病，嚴重威脅兒童的健康。維生素Ａ缺乏的兒童易患各種感染性疾病，給予足量的維生素Ａ可有效預防感染性疾病并降低死亡率，這種作用可能與維生素Ａ及其活性代謝產(chǎn)物視黃酸ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ＲＡ的免疫調節作用有關(guān)。實(shí)驗證明類(lèi)維生素Ａ對Ｔ、Ｂ淋巴細胞均有作用，維生素Ａ通過(guò)與其受體ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓＲＡＲ結合而發(fā)揮作用。我們既往的研究中也發(fā)現ＲＡ通過(guò)ＲＡＲα途徑促進(jìn)ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞向ＣＤ４＋細胞分化，抑制其向ＣＤ８＋細胞分化１，但其機制尚不清楚。近年研究發(fā)現，Ｎｏｔｃｈｓ受體的表達與活化在淋巴細胞的發(fā)育中起重要作用２ Ｎｏｔｃｈ是一組跨膜受體，在多種器官及細胞的發(fā)育中起作用，主要決定細胞的分化方向３。在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現４類(lèi)Ｎｏｔｃｈ基因，編碼４種Ｎｏｔｃｈ受體，分別為Ｎｏｔｃｈ１～４。在Ｎｏｔｃｈ受體家族中，Ｎｏｔｃｈ１與Ｔ淋巴細胞的發(fā)育密切相關(guān)。ＲＡ對人胸腺細胞Ｎｏｔｃｈ１基因的表達有無(wú)作用，以及ＲＡ對胸腺細胞發(fā)育的調節作用是否與Ｎｏｔｃｈ１途徑有關(guān)，尚未見(jiàn)報道。故我們通過(guò)檢測胸腺細胞發(fā)育過(guò)程中Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表達變化，并觀(guān)察ＲＡ對其表達的影響，探討ＲＡ對胸腺細胞分化發(fā)育的作用機制。
１ 材料與方法
１．１ 標本來(lái)源 ８例胸腺組織來(lái)源于復旦大學(xué)兒科醫院先天性心臟病兒童在進(jìn)行心臟修補手術(shù)時(shí)為暴露手術(shù)視野切除之部分胸腺，年齡均小于１歲。所有兒童均為單純房缺或室缺，心功能和生長(cháng)發(fā)育良好，其母懷孕期間無(wú)維生素缺乏病史。在取標本期間未接受任何影響免疫功能的治療，如放射、激素及免疫抑制治療等。
１．２ 胸腺組織培養與細胞表面標志分析 參照文獻４，并按加入的培養液的不同分為空白對照組ｃｏｎｔｒｏｌＣ、視黃酸組ＲＡ、ＲＡ＋ Ｒｏ４１－５２５３組ＡＯ組，置３７℃、５％ＣＯ２培養箱中，各組均分別培養２４、４８、７２ｈ，并在各時(shí)間點(diǎn)分離收集胸腺細胞，制成細胞懸液，加熒光標記的抗ＣＤ４、ＣＤ８單克隆抗體染色后，并同時(shí)用熒光標記的抗ＣＤ３單克隆抗體染色作為分選指標，用流式細胞儀ＦＡＣＳｃａｎ ＢＤ公司分析結果。
１．３ 總ＲＮＡ抽提及逆轉錄ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ ＲＴＰＣＲ：取各時(shí)間點(diǎn)胸腺細胞，采用 ＴＲＩｚｏｌ抽提總ＲＮＡ，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行并逆轉錄合成ｃＤＮＡ，擴增，并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ 分析。
１．４ 數據處理：應用ＳＰＳＳ統計軟件進(jìn)行處理。采用雙因素方差分析，并進(jìn)行相關(guān)分析。以均數±標準差Ｘ±ｓ表示，Ｐ＜０．０５為差異有顯著(zhù)性。
２ 結果
２．１ 視黃酸受體活化與阻抑對胸腺細胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ表達的影響
我們試驗中發(fā)現胸腺細胞與胸腺基質(zhì)細胞均表達Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ圖１。實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ結果顯示，正常對照組胸腺細胞在體外培養７２ｈ的過(guò)程中Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ并無(wú)明顯變化，但在ａｔＲＡ活化視黃酸受體后，胸腺細胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表達在培養２４ｈ即明顯下降，與同一時(shí)間點(diǎn)對照組比差異有顯著(zhù)性Ｐ＝０．０４７，并能持續到培養７２ｈ；加入ＲＡＲα受體特異性拮抗劑Ｒｏ４１ ５２５３并不能完全拮抗ａｔＲＡ對胸腺細胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ表達的下調作用圖２。
２．２ Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ表達與胸腺細胞表型分化的關(guān)系
體外培養過(guò)程中胸腺細胞各種表型的變化：采用流式細胞儀分析視黃酸受體的活化與阻抑對胸腺細胞成熟分化的影響，結果顯示，在加入ＲＡ激活視黃酸受體后 ２４ｈ，ＣＤ４＋胸腺細胞明顯增加，與對照組相比差異顯著(zhù)Ｐ＜０．０５；這種作用在加入視黃酸受體α的特異性拮抗劑Ｒｏ４１ ５２５３后則消失，與同時(shí)間點(diǎn)對照組無(wú)差異圖３。但另一方面，視黃酸受體被活化后ＣＤ８＋細胞的百分數卻降低，而該作用可被ＲＡＲα受體特異性拮抗劑所抑制圖４。
我們發(fā)現ＲＡ組胸腺細胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ表達變化在培養２４ｈ下降，而此時(shí)該組ＣＤ４＋百分數的變化在培養２４ｈ則上升，二者變化趨勢相反。在體外培養２４－４８ｈ ＲＡ組ＣＤ８＋細胞的百分數下降圖４，該時(shí)間點(diǎn)胸腺細胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表達均維持在較低水平，但無(wú)明顯相關(guān)性。
３ 討論
Ｎｏｔｃｈｓ受體的表達與活化在淋巴細胞的發(fā)育中起重要作用１，在Ｎｏｔｃｈ受體家族中，Ｎｏｔｃｈ１與Ｔ淋巴細胞的發(fā)育密切相關(guān)。故我們通過(guò)檢測胸腺細胞發(fā)育過(guò)程中Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表達變化，探討維生素Ａ對胸腺細胞分化發(fā)育的作用機制。
Ｎｏｔｃｈ１在胸腺細胞不同的分化階段的表達變化對維持胸腺細胞的正常發(fā)育至關(guān)重要。Ｈａｓｓｅｒｊｉａｎ等２發(fā)現，胸腺細胞在由ＣＤ４－ＣＤ８－向ＣＤ４＋ＣＤ８＋的分化過(guò)程中，Ｎｏｔｃｈ１的表達下調，這對維持早期胸腺細胞的分化發(fā)育可能有重要意義。由于持續表達活化的Ｎｏｔｃｈ１蛋白能抑制正常皮質(zhì)胸腺細胞的分化，導致Ｔ細胞白血病５，故在ＣＤ４＋ＣＤ８＋階段的Ｎｏｔｃｈ１表達下調可能有利于ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞的進(jìn)一步分化。
近年研究發(fā)現，表達持續活化的Ｎｏｔｃｈ１可促進(jìn)ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞傾向于向ＣＤ８＋分化發(fā)育，抑制向ＣＤ４＋方向分化６。反義抑制內源性Ｎｏｔｃｈ１有利于ＣＤ４＋Ｔ淋巴細胞的發(fā)育７。故我們推測，本研究中加ＲＡ后ＣＤ４＋細胞在培養２４ｈ后有所增加，可能由于ＲＡ抑制了Ｎｏｔｃｈ１的表達，使胸腺細胞向ＣＤ４＋、ＣＤ８＋的分化發(fā)生偏離，有利于ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞向ＣＤ４＋方向分化，抑制其向ＣＤ８＋分化。
總之，我們的研究顯示，視黃酸能促進(jìn)促進(jìn)ＣＤ４＋細胞的發(fā)育，抑制Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表達，視黃酸對胸腺細胞分化的調節作用，可能與其抑制Ｎｏｔｃｈ１信號途徑有關(guān)。由于ＣＤ４＋細胞在細胞免疫以及活化輔助Ｂ細胞產(chǎn)生抗體的過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，本研究為臨床合理使用維生素Ａ制劑增強兒童免疫功能提供了理論依據。
參考文獻：
１． 周小建，王衛平，楊 毅． 視黃酸對人胸腺細胞成熟分化的影響及其作用途徑． 營(yíng)養學(xué)報，２００４，２６１９－１２．
２． Ｈａｓｓｅｒｊｉａｎ ＲＰ Ａｓｔｅｒ ＪＣ Ｄａｖｉ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｏｔｃｈ１ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｂｌｏｏｄ １９９６，８８３９７０－９７６．
３． 周小建，王衛平，楊 毅． Ｎｏｔｃｈ 信號通路與Ｔ淋巴細胞發(fā)育． 國外醫學(xué)免疫學(xué)分冊，２００４ ２７５２５２－２５６．
４． Ｍａｎｄｅｌ ＴＥ Ｋｅｎｎｅｄｙ ＭＭ． Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９７８ ３５３１７－３３１．
５． Ｗｅｎｇ ＡＰ Ｎａｍ Ｙ Ｗｏｌｆｅ ＭＳ ｅｔ ａｌ． Ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅＴ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００３，２３２６５５－６６４．
６． Ｙａｓｕｔｏｍｏ Ｋ Ｄｏｙｌｅ Ｃ Ｍｉｅｌｅ Ｌ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ＣＤ４＋ ｖｅｒｓｕｓ ＣＤ８＋ Ｔｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｆａｔｅ． Ｎａｔｕｒｅ ２０００，４０４６７７７５０６－５１０．
７． Ｗｏｌｆｅｒ Ａ Ｗｉｌｓｏｎ Ａ Ｎｅｍｉｒ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ１ ｉｍｐａｉｒｓ ＶＤＪｂｅｔａ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ ａｌｌｏｗｓ ｐｒｅＴＣＲｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｅａｒｌｙ ａｌｐｈａ ｂｅｔａ ｌｉｎｅａｇｅ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００２， １６６８６９－８７９． | 