孫長(cháng)顥 周曉蓉 王舒然 劉 榮 哈爾濱醫科大學(xué)公共衛生學(xué)院,營(yíng)養與食品衛生學(xué)教研室，哈爾濱 １５００８６
摘 要 目的 通過(guò)研究共軛亞油酸ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ，ＣＬＡ對飲食誘導肥胖大鼠解偶聯(lián)蛋白２（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＵＣＰ２）基因表達的影響，探討ＣＬＡ降低體重、體脂作用的機制。方法 選用雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，隨機分為對照組、高脂組、高脂＋ＣＬＡ組（每１００ｇ飼料含ＣＬＡ分別為０．７５ｇ、１．５０ｇ、３．００ｇ），每組動(dòng)物１０只，觀(guān)察ＣＬＡ對肥胖大鼠體重、體脂、血脂水平的影響，并應用ＲＴ－ＰＣＲ的方法檢測ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表達水平。結果 ＣＬＡ可降低飲食誘導肥胖大鼠的體重和體脂含量，降低血清甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸水平，并可增加肥胖大鼠脂肪組織ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表達水平。結論 ＣＬＡ可改善肥胖大鼠的脂代謝紊亂，增加ＵＣＰ２基因的表達，發(fā)揮降低體重、體脂的作用。
關(guān)鍵詞 共軛亞油酸；解偶聯(lián)蛋白２；肥胖；脂代謝紊亂
Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＵＣＰ２ ｉｎ ｏｂｅｓｅ ｒａｔ ｆｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ ＳＵＮ Ｃｈａｎｇｈａｏ ＺＨＯＵ Ｘｉａｏｒｏｎｇ ＷＡＮＧ Ｓｈｕｒａｎ ＬＩＵ Ｒｏｎｇ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｈａｒｂｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨａｒｂｉｎ １５００８６ Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄＣＬＡ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＵＣＰ２） ｉｎ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｏｂｅｓｅ ｒａｔｓ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｏｂｅｓｅｓ ｒａｔｓ ｂｙ ＣＬＡ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｌｅ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｆａｔ ＋ ＣＬＡ ｇｒｏｕｐ０．７５ｇ、１．５０ｇ、３．００ｇ％ ｂｙ ｄｉｅｔ ｗｅｉｇｈｔ． Ｗｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｌｉｐｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ＲＴＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＵＣＰ２． Ｒｅｓｕｌｔｓ ＣＬＡ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｒｕｍ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ ｉｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｏｂｅｓｅ ｒａｔ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＣＬＡ ｃａｎ ｉｍｐｒｏｖｅ ｄｙｓｌｉｐｉｄａｅｍｉａ ｏｆ ｏｂｅｓｅ ｒａｔ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｗｅｉｇｈｔ ｂｏｄｙ ａｎｄ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｂｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ；ＵＣＰ２ ；ｏｂｅｓｅｓ；ｄｙｓｌｉｐｉｄａｅｍｉａ 肥胖一種慢性能量平衡失調癥，已成為威脅人類(lèi)健康的主要疾病，尋找肥胖的發(fā)病機理及防治措施的研究一直是國內外研究的熱點(diǎn)之一。解偶聯(lián)蛋白ＵＣＰｓ是線(xiàn)粒體內膜上的一種轉運蛋白，它能夠降低線(xiàn)粒體內膜上的質(zhì)子梯度，使底物氧化和ＡＤＰ磷酸化解偶聯(lián)，減少ＡＴＰ的產(chǎn)生，使物質(zhì)氧化后產(chǎn)生的能量以熱量的形式散發(fā)出去，因而它與能量代謝密切相關(guān)，目前已經(jīng)將ＵＣＰｓ列為肥胖的候選基因。ＣＬＡ是一種膳食性脂肪酸，主要含有ｃ９ｔ１１ 和ｔ１０ｃ１２兩種同分異構體，后者具有降低體重作用，但其作用機制尚不清楚。本文將通過(guò)觀(guān)察ＣＬＡ對飲食誘導肥胖大鼠脂肪組織ＵＣＰ２基因的影響，探討ＣＬＡ的降低體重的作用機制，從而對肥胖癥的預防和治療提供更大的幫助。
１ 材料與方法
１．１ 材料
（１）共軛亞油酸：購于中國青島澳海生物有限公司，其中ｃ９ｔ１１含量為３８．１７％，ｔ１０ｃ１２含量為４２．２５％。
（２）試劑盒：①血脂測定試劑盒：購于北京中生生物有限公司。②游離脂肪酸試劑盒：德國Ｒｏｃｈｅ 公司。
１．２ 方法
１實(shí)驗動(dòng)物：８０～１００ｇ雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠購于上海醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心，觀(guān)察１周后，按體重將動(dòng)物隨機分為５組，每組１０只，即基礎對照組、高脂組、ＣＬＡ高、中、低劑量組每１００ｇ飼料中含ＣＬＡ分別為３．００ｇ、１．５０ｇ、０．７５ｇ，每周稱(chēng)重１次，記錄給食量和撒食量。于第１２周末乙醚麻醉處死動(dòng)物（處死前１２ｈ空腹），腹主動(dòng)脈采血，檢測游離脂肪酸、血糖、胰島素，取睪周和腎周脂肪稱(chēng)重記錄，并留取睪周脂肪迅速放入液氮中冷凍以備檢測ｍＲＮＡ。
２飼料配方：參照ＡＯＡＣ配方和實(shí)驗大鼠合成飼料配方ＡＩＮ９３，選用純合成飼料，其所含營(yíng)養素和能量能保證大鼠生長(cháng)發(fā)育的基本要求，在此基礎上調整脂肪、淀粉含量就配成高脂飼料，并根據要求調整ＣＬＡ含量，飼料成分見(jiàn)表１。
３檢測指標 ①脂體比的計算：脂體比＝睪周脂肪重量（ｇ）＋腎周脂肪重量（ｇ）體重（ｇ）×１００。② 血脂測定：按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
１．３ ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ測定
按ＧＩＢＣＯ公司總ＲＮＡ提取試劑盒的操作步驟，從１００ｍｇ大鼠白色脂肪組織中提取總ＲＮＡ，逆轉錄反應以總ＲＮＡ２μｇ為模板，ＵＣＰ２和βａｃｔｉｎ基因采用ｏｌｉｇｏＤＴ為逆轉錄引物，加入逆轉錄酶ＡＭＶ１０Ｕ，總反應體系為２０μｌ，４２℃水浴２ｈ，合成第一條ｃＤＮＡ鏈，ＰＣＲ反應以逆轉錄產(chǎn)物２μｌ為模板，引物序列見(jiàn)表２，加入引物２０ｐｍｏｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．３５μｌ，總反應體系為２５μｌ，ＰＣＲ擴增條件為：βａｃｔｉｎ為９４℃變性３０ｓ、５７℃退火３０ｓ、７２℃延伸４０ｓ ３０個(gè)循環(huán)；ＵＣＰ２為９４℃變性３０ｓ、５８℃退火４０ｓ、７２℃延伸４０ｓ，３５個(gè)循環(huán)。ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)２％瓊脂糖凝膠電泳，并與ＤＮＡ標準分子比較鑒定之后，在數字成相儀上照相，掃描分析。
１．４ 結果分析
運用ＳＡＳ６．１２軟件包，數據以均數±標準差（Ｘ±ｓ）來(lái)描述，組間差異采用方差分析進(jìn)行處理。
２ 結果
２．１ ＣＬＡ對大鼠體重及脂體比的影響（表３）
由表３可見(jiàn)，各組大鼠初始體重無(wú)顯著(zhù)性差異，基礎組終末體重、脂體比低于高脂組；ＣＬＡ組大鼠隨劑量增加，體重和脂體比逐漸下降，各劑量組與高脂組比差異均有顯著(zhù)性（Ｐ＜０．０５）。
２．２ ＣＬＡ對大鼠血脂水平的影響（表４）
由表４可見(jiàn)，與基礎對照組比較，高脂組大鼠血清甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸水平明顯增高（Ｐ＜０．０５），表明高脂飲食誘導的肥胖大鼠出現了脂代謝紊亂。而ＣＬＡ組大鼠血清甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸水平與高脂組相比明顯下降，且有劑量反應關(guān)系（Ｐ＜０．０５），表明ＣＬＡ具有改善脂代謝紊亂的作用。
２．３ ＣＬＡ對大鼠脂肪組織ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ基因表達的影響（圖１，２）
由圖１、２可見(jiàn)，高脂組大鼠脂肪組織ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表達略高于基礎組，而ＣＬＡ各劑量組ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表達均高于高脂組，且隨著(zhù)劑量升高，其表達也逐漸增強。
３ 討論
目前已發(fā)現的ＵＣＰｓ有５種，其中ＵＣＰ２表達的范圍較廣，在人體代謝率方面有重要的作用，所以認為它與肥胖的關(guān)系最為密切。Ｏｂｅｒｋｏｆｌｅｒ等２通過(guò)比較肥胖者與正常對照者腹膜脂肪組織ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表達水平發(fā)現，肥胖者腹膜脂肪組織ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ表達減弱，Ｅｍｉｌｓｓｏｎ等３發(fā)現，肥胖大鼠的棕色脂肪組織、白色脂肪組織和骨骼肌ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表達水平比非肥胖鼠下降１３、１２，以上研究提示ＵＣＰ２表達降低可能使能量消耗減少而導致肥胖。
本研究結果顯示，試驗結束時(shí)高脂飲食組大鼠體重、脂體比明顯高于基礎組Ｐ＜０．０５；與基礎組相比，高脂組甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸水平升高，高密度脂蛋白膽固醇明顯降低，Ｐ＜０．０５。說(shuō)明高脂飲食誘導大鼠出現了肥胖和脂代謝紊亂。而ＣＬＡ各組大鼠體重、體脂含量、甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸水平顯著(zhù)低于高脂組，且有劑量－反應關(guān)系，表明ＣＬＡ具有降低體重、體脂含量，改善脂代謝紊亂的作用。
為探討ＣＬＡ降低體重的作用機制，本實(shí)驗檢測了大鼠白色脂肪組織ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表達情況。結果顯示，高脂組大鼠脂肪組織ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表達較基礎組略高，肥胖大鼠脂肪組織ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ表達增加也許是機體防止能量過(guò)剩的代償反應，而ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ表達的相對不足可能是肥胖發(fā)生的原因之一。肥胖時(shí)解偶聯(lián)蛋白不下降甚至升高，提示可能因能量攝入過(guò)多，超過(guò)了解偶聯(lián)蛋白的代償能力。而ＣＬＡ各組大鼠脂肪組織ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ表達較高脂組升高，且有劑量反應關(guān)系，說(shuō)明ＣＬＡ可通過(guò)增加ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表達，發(fā)揮降低體重作用。據報道，ＵＣＰ２受核受體ＰＰＡＲγ的調控，ＰＰＡＲγ可增加ＵＣＰ２的表達４。而本實(shí)驗室的其它研究還表明ＣＬＡ可激活ＰＰＡＲγ５。因此推測ＣＬＡ可能通過(guò)激活ＰＰＡＲγ上調ＵＣＰ２基因的表達，增加能量消耗，降低動(dòng)物體重。肥胖可引起胰島素抵抗，是２型糖尿病的主要危險因素。ＣＬＡ可使體重降低，無(wú)疑對改善胰島素抵抗，預防糖尿病的發(fā)生具有重要意義。
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