周曉蓉 孫長(cháng)顥 王海英 姜麗英 劉 榮(哈爾濱醫科大學(xué)公共衛生學(xué)院,哈爾濱 150001) 摘 要:目的 通過(guò)研究共軛亞油酸conjugated linoleic acid,CLA對飲食誘導肥胖大鼠脂肪酸連接蛋白(fatty acid binding proteins,ap2)基因表達的影響,探討CLA抗糖尿病作用的機制。方法 選用雄性Wistar大鼠,隨機分為對照組、高脂組、高脂+CLA組(每100g飼料含CLA分別為0.75g、1.50g、3.00g),每組動(dòng)物10只,觀(guān)察CLA對肥胖大鼠胰島素、血糖水平的影響,并應用RT-PCR的方法檢測ap2、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達水平。結果 高脂組大鼠血清游離脂肪酸(free fatty acids FFA)、胰島素和糖血水平分別為0.74±0.05(mmolL)、11.11±2.73μIUml,5.09±0.66mmolL,CLA 可降低肥胖大鼠血清FFA、血糖、胰島素水平,低、中、高劑量組FFA水平分別為0.69±0.05(mmolL)、0.61±0.06(mmolL)、0.58±0.06(mmolL),胰島素水平分別為6.99±1.77μIUml,7.36±1.48μIUml,7.85±1.60μIUml(P<0.05),血糖水平分別為4.28±0.72mmolL,4.18±0.55mmolL(P<0.05),4.06±0.63mmolL(P<0.05),且CLA可增加肥胖大鼠脂肪組織ap2、PPARγ mRNA的表達水平。結論 CLA可通過(guò)激活PPARγ上調脂肪酸連接蛋白基因的表達,改善肥胖大鼠的胰島素抵抗。 關(guān)鍵詞 脂肪酸連接蛋白;過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ;胰島素抵抗 Abstract Objective To study the effect of conjugated linoleic acid on expression of fatty acid binding proteins(ap2) and PPARγ in white obesity tissue of obese rats and explore the mechanism of resisting diabetes by CLA.Methods Male Wistar rats were randomly separated to control group high-fat group and high fat+CLA group0.75g、1.50g、3.00g% by deit weight Using reverse transcription polymerse chain reaction RT-PCR technique to measure the expression level of adiponectin and PPARγmRNA expression. Results The FFAserum insulin and glucose levels of obese rats were0.74±0.05(mmolL)、11.11±2.73μIUml5.09±0.66mmolLsupplement of CLA can decrease hyperinsulinemia and hyperglycemia CLA group0.75g、1.50g、3.00g% by deit weight serum FFA were 0.69±0.05(mmolL)、0.61±0.06(mmolL)、0.58±0.06(mmolL),serum insulin were 6.99±1.77μIUml,7.36±1.48μIUml,7.85±1.60μIUml(P<0.05)glucose were 4.28±0.72mmolL,4.18±0.55mmolL(P<0.05),4.06±0.63mmolL(P<0.05) CLA can increase the expression of ap2 and PPARγ mRNA in adipose tissue of obese rat. Conclusions CLA can improve insulin resistance of obese rat and increace the expression of ap2 mRNA possibly acting through activing peroxisome proliferator -activated receptor-γPPARγ. Keywords ap2;PPARγ;insulin resistance
肥胖者由于體內脂肪組織的過(guò)度積聚,可導致脂肪組織脂解增加,釋放過(guò)多的游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)使血漿FFA濃度逐漸增高,進(jìn)而引發(fā)一系列病理生理反應。研究表明FFA升高對機體血糖自穩狀態(tài)產(chǎn)生多途徑的損害,可直接導致胰島素抵抗,而胰島素抵抗是2型糖尿病的發(fā)病基礎1。因此,糾正高FFA對穩定血糖,改善胰島素抵抗,防止糖尿病的發(fā)生具有非常重要的意義。 CLA是一種膳食脂肪酸,主要含有c9t11-182和t10c12-182兩種同分異構體,后者具有抗糖尿病的作用。它可降低肥胖大鼠的FFA水平,改善胰島素抵抗2,但其作用機制尚不清楚。本文將通過(guò)觀(guān)察CLA對飲食誘導肥胖大鼠胰島素抵抗形成過(guò)程中脂肪組織ap2基因的影響,探討CLA的抗糖尿病作用機制,從而對糖尿病的預防和治療提供更大的幫助。
1 材料與方法 1.1 材料 共軛亞油酸:購于中國青島澳海生物有限公司,其中c9,t11-182 含量為38.17%,t10,c12-182含量為42.25%。胰島素放免試劑盒:德普公司。血糖儀及試紙:美國強生公司。游離脂肪酸試劑盒:德國Roche公司 1.2 實(shí)驗動(dòng)物和飼料 80~100g雄性Wistar大鼠購于上海醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心,觀(guān)察一周后,按體重將動(dòng)物隨機分為5組,每組10只,即基礎對照組、高脂組及CLA高、中、低劑量組每100g飼料中含CLA分別為3.00g、1.50g、0.75g,每周稱(chēng)重一次,記錄給食量和撒食量,飼料構成見(jiàn)表1。于第12周末乙醚麻醉處死動(dòng)物(處死前12h空腹),腹主動(dòng)脈采血,檢測游離脂肪酸、血糖、胰島素,取睪周和腎周脂肪稱(chēng)重記錄,并留取睪周脂肪迅速放入液氮中冷凍以備檢測mRNA。

1.3 脂體比的計算 脂體比=睪周脂肪重量(g)+腎周脂肪重量(g)體重(g)×100 1.4 游離脂肪酸測定 按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。 1.5 胰島素測定 放免法,按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。 1.6 血糖測定 取一滴血用血糖儀(試紙)測全血血糖。 1.7 PPARγ、ap2 mRNA測定 按GIBCO公司總RNA提取試劑盒的操作步驟,從100mg大鼠白色脂肪組織中提取總RNA,逆轉錄反應以總RNA2μg為模板,PPARγ、ap2和β-actin基因采用OligoDT為逆轉錄引物,加入逆轉錄酶AMV10U,總反應體系為20μl,42℃水浴2h,合成第一條cDNA鏈,PCR反應以逆轉錄產(chǎn)物2μl為模板,引物序列見(jiàn)表2,加入引物20pmol,Taq DNA聚合酶0.35μl,總反應體系為25μl,PCR擴增條件為:β-actin為94℃變性30s、57℃退火30s、72℃延伸40s 30個(gè)循環(huán);PPARγ為94℃變性30s、65℃退火30s、72℃延伸40s,35個(gè)循環(huán);ap2為95℃變性30s、53℃退火1min、72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,并與DNA標準分子比較鑒定之后,在數字成相儀上照相,掃描分析。

1.8 結果分析 運用SAS6.12軟件包,數據以均數±標準差(X±s)來(lái)描述,組間差異采用方差分析進(jìn)行處理。
2 結果 2.1 CLA對大鼠體重、脂體比的影響 結果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn),各組大鼠初始體重沒(méi)有顯著(zhù)性差異,基礎組終末體重、脂體比低于高脂組,P<0.05。CLA組隨劑量增加,體重和脂體比逐漸下降,CLA各劑量組與高脂組比P<0.05。 2.2 CLA對大鼠胰島素、血糖、游離脂肪酸的影響結果見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn),與基礎對照組比較,高脂組大鼠血清游離脂肪酸水平顯著(zhù)增加,而且高脂組大鼠血糖及血清胰島素水平明顯增高,胰島素敏感性指數下降,經(jīng)統計學(xué)分析,P<0.05,說(shuō)明高脂飲食誘導的肥胖大鼠出現了胰島素抵抗。而CLA組大鼠血清游離脂肪酸、胰島素及血糖水平與高脂組相比明顯下降,胰島素敏感指數明顯增加,P<0.05,說(shuō)明CLA具有降低游離脂肪酸水平,改善胰島素抵抗的作用。 2.3 CLA對大鼠脂肪組織PPARγ、ap2 mRNA基因表達的影響 1大鼠脂肪組織PPARγmRNA的表達 由圖1和圖2的光密度掃描結果可見(jiàn),高脂組大鼠白色脂肪組織PPARγ mRNA表達水平略高于基礎組,CLA組大鼠白色脂肪組織PPARγ mRNA的表達水平隨劑量增加逐漸增強,且明顯高于高脂組。


2大鼠脂肪組織ap2 mRNA的表達 由圖3和圖4可見(jiàn),高脂組大鼠脂肪組織ap2 mRNA的表達高于基礎組,CLA各實(shí)驗組大鼠ap2 mRNA表達較高脂組明顯增加,且隨著(zhù)劑量的升高,其表達也逐漸增強。


3 討論 肥胖者脂肪組織增加后,機體由于自身的穩態(tài)調節作用,增多的脂肪組織更趨向于代謝分解,造成FFA進(jìn)一步增高,高濃度的FFA可通過(guò)多種途徑影響胰島素的作用及葡萄糖代謝,與胰島素抵抗的發(fā)生有密切關(guān)系。因此降低FFA、研究脂代謝機制對于改善胰島素抵抗、預防2型糖尿病的發(fā)生具有重要意義。 本研究結果顯示,各組動(dòng)物實(shí)驗前體重無(wú)顯著(zhù)性差異(P>0.05),試驗結束時(shí)高脂飲食組大鼠體重、脂體比明顯高于基礎組P<0.05,說(shuō)明高脂飲食誘導大鼠出現了肥胖,而CLA各劑量組大鼠體重、脂體比明顯低于高脂組大鼠(P<0.05),且有劑量反應關(guān)系,說(shuō)明CLA具有降低體重的作用。肥胖可導致脂類(lèi)代謝異常。 本實(shí)驗結果表明,高脂組大鼠血糖和血清FFA水平明顯高于基礎組(P<0.05),根據葡萄糖脂肪酸循環(huán)學(xué)說(shuō)3,FFA與葡萄糖之間存在著(zhù)氧化競爭。肥胖時(shí)FFA增加,導致脂肪酸β氧化增強,抑制葡萄糖的氧化和酵解,從而引起血糖升高。血糖升高可進(jìn)一步刺激胰島素的釋放,因而可導致高胰島素血癥。過(guò)量分泌的胰島素不能維持正常的血糖水平,就產(chǎn)生了胰島素抵抗。胰島素抵抗表現為胰島素敏感性降低,胰島素敏感性指數是反映胰島素抵抗的較好的指標。本實(shí)驗結果顯示,高脂組大鼠血糖、胰島素水平顯著(zhù)高于基礎組(P<0.05),胰島素敏感性指數顯著(zhù)低于基礎組(P<0.05),形成了高胰島素血癥和胰島素抵抗。而CLA各組血糖和FFA較高脂組明顯降低,且有劑量反應關(guān)系,說(shuō)明CLA可通過(guò)降低FFA,減少其與葡萄糖氧化的競爭,發(fā)揮其降血糖作用。另外,CLA各組動(dòng)物胰島素水平顯著(zhù)低于高脂組(P<0.05),胰島素敏感性指數顯著(zhù)高于高脂組(P<0.05),說(shuō)明CLA具有顯著(zhù)的降胰島素作用,可通過(guò)提高胰島素敏感性指數,增加胰島素敏感性,改善胰島素抵抗。 PPARγ是誘導脂肪細胞分化的關(guān)鍵調控因子,與PPARγ配基結合后可被激活,調節體內許多與糖代謝和脂代謝有關(guān)的基因轉錄,從而發(fā)揮抗糖尿病作用。已經(jīng)確認,ap2是PPARγ下游的涉及到脂類(lèi)儲存并調節脂類(lèi)代謝的靶基因,脂肪組織PPARγ表達的增減可能會(huì )影響該目標基因的表達,繼而影響能量代謝的平衡。 細胞吸收脂肪酸包括主動(dòng)擴散和被動(dòng)轉運兩種情況。在生理濃度范圍內,90%以上的脂肪酸經(jīng)過(guò)蛋白轉運途徑進(jìn)行轉運4。一些脂類(lèi)分子在細胞內外液體環(huán)境中的水溶性差,但對生命細胞有重要意義,脂肪酸結合蛋白可增加它們的溶解性,并負責它們的轉運。脂肪酸在胞質(zhì)內由脂肪酸結合蛋白轉運。脂肪酸結合蛋白的結構特點(diǎn)決定了它對親脂類(lèi)化合物有親和性,一個(gè)蛋白可結合兩個(gè)疏水分子。長(cháng)鏈脂肪酸在細胞內與脂肪酸結合蛋白結合后,增加了水溶性,可被迅速轉運到脂肪酸氧化等位點(diǎn)發(fā)揮作用。脂肪酸結合蛋白在脂肪酸的吸收和利用,以及保持脂代謝穩定方面起重要作用。Binas等5利用基因打靶技術(shù)建立了H-FABP缺陷型鼠模型,該鼠表現為對外周長(cháng)鏈脂肪酸利用缺陷。Atshaves等6發(fā)現,高水平的飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸可引起脂類(lèi)堆積,對細胞產(chǎn)生脂毒作用,細胞內尤其是脂肪細胞內脂肪酸結合蛋白ap2的高表達可刺激脂肪細胞攝入FFA,減少脂類(lèi)堆積,削弱它對細胞的毒作用。 由于PPARγ在脂肪組織分化中起關(guān)鍵作用,可增加胰島素敏感性,因此設想肥胖致胰島素抵抗可能與PPARγ在體內的表達失調或降低有關(guān)。但本研究結果表明,高脂組大鼠脂肪組織PPARγmRNA表達較基礎組大鼠略有增加,我們認為肥胖鼠PPARγmRNA表達增加可能是機體為了維持正常的胰島素敏感性而出現的代償現象,而CLA各組大鼠脂肪組織PPARγmRNA表達較高脂組明顯增加,且隨著(zhù)劑量的增加,其表達增強,說(shuō)明CLA可激活PPARγ,而高脂組大鼠PPARγmRNA表達的相對不足是產(chǎn)生胰島素抵抗的原因之一。 由大鼠脂肪組織ap2基因表達的情況可以看出,高脂組大鼠脂肪組織ap2 mRNA表達略高于基礎組。與高脂組過(guò)高的FFA相比,脂肪組織這些基因的表達相對不足,刺激脂肪細胞攝入FFA的能力有限,可能是高脂組大鼠血清FFA過(guò)高、產(chǎn)生胰島素抵抗的的原因之一。與高脂組相比,CLA各實(shí)驗組大鼠脂肪組織ap2 mRNA表達均明顯增加,且有劑量反應關(guān)系,并與PPARγ mRNA的表達趨勢一致,說(shuō)明CLA可通過(guò)激活PPARγ上調ap2 mRNA基因的表達,增加脂肪組織對FFA的攝入,降低循環(huán)中FFA的濃度,減少FFA達到骨骼肌的濃度。正常情況下,骨骼肌是負責葡萄糖利用的主要組織,而肝臟和脂肪組織僅僅最低限度地(<10%)促進(jìn)葡萄糖的利用,因此,CLA可通過(guò)上述機制改善胰島素抵抗、發(fā)揮抗糖尿病作用。
參考文獻:
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