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摘要：目的 建立優(yōu)化外周血核黃素及其衍生物水平的HPLC微量測定方法，探討其對核黃素營(yíng)養狀況變化的靈敏性、特異性，同時(shí)為建立我國成年人正常外周血核黃素及其衍生物水平提供初步數據。方法 通過(guò)大鼠核黃素缺乏與補充實(shí)驗，比較血漿、紅細胞核黃素及其衍生物對于核黃素營(yíng)養狀況變化反應的靈敏性、特異性；進(jìn)一步通過(guò)人體試驗，驗證動(dòng)物實(shí)驗的結果。結果 建立了外周血核黃素及其衍生物水平的HPLC微量測定方法；大鼠核黃素缺乏后，尿核黃素排出量迅速下降，血漿核黃素水平也顯著(zhù)下降，隨之血漿、紅細胞核黃素衍生物也呈下降趨勢，補充核黃素后，上述指標趨于恢復；核黃素營(yíng)養不良的人體志愿者補充核黃素后，血漿核黃素水平也迅速恢復。結論 血漿核黃素是評價(jià)核黃素營(yíng)養狀況的靈敏指標，適宜應用于核黃素營(yíng)養狀況的評價(jià)。
關(guān)鍵詞：核黃素；營(yíng)養評價(jià)
核黃素（ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ）又稱(chēng)維生素Ｂ２，在體內以黃素腺嘌呤二核苷酸（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＦＡＤ）、黃素單核苷酸（ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＦＭＮ）兩種衍生物形式在體內作為輔酶參與氧化還原反應，與能量代謝密切相關(guān)；另外，核黃素在體內還參與維生素Ｂ６和煙酸等的代謝［１２］。
我國居民傳統的膳食結構不盡合理，核黃素攝入不足一直是我國居民膳食中存在的重要營(yíng)養問(wèn)題之一。全國第三次營(yíng)養調查結果顯示我國居民的核黃素平均每標準人每日攝入量?jì)H為０．８ｍｇ，是１９８８年制定的ＲＤＡ的５８．４％，全國第四次營(yíng)養調查結果出現了類(lèi)似結果。自上世紀５０年代以后，有關(guān)核黃素營(yíng)養狀況評價(jià)方法的研究有了較大的進(jìn)展，國外一些實(shí)驗室相繼研究建立了靈敏的紅細胞谷胱甘肽還原酶活性系數法。國內顧景范等通過(guò)對國外方法的改進(jìn)，建立了適合我國國情的全血谷胱甘肽還原酶活性系數（Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ＢＧＲＡＣ）測定方法３，該法目前已經(jīng)廣泛應用于國內核黃素代謝和營(yíng)養狀況評價(jià)的研究之中。但是，ＢＧＲＡＣ作為核黃素營(yíng)養狀況的評價(jià)指標仍然為間接性的評價(jià)指標，從理論上而言，外周血或組織臟器的核黃素水平才是核黃素營(yíng)養狀況直接性的評價(jià)指標。由于過(guò)去核黃素的測定需要采用繁瑣復雜的微生物法或熒光法，不能區分核黃素及其衍生物，難于應用于實(shí)際工作中大批量樣品的測定，也難于滿(mǎn)足研究工作深入的需要。隨著(zhù)高效液相色譜（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）技術(shù)的不斷發(fā)展和應用，生物樣品中微量核黃素的準確測定已經(jīng)成為現實(shí)。我們曾采用ＨＰＬＣ技術(shù)建立了大鼠外周血核黃素的測定方法，初步試驗結果顯示動(dòng)物喂養核黃素缺乏飼料后，外周血核黃素水平急劇下降，下降幅度明顯大于ＢＧＲＡＣ的下降幅度４。因此，有必要進(jìn)一步探討血漿核黃素及其衍生物應用于核黃素營(yíng)養狀況評價(jià)的可能性。
１．ＨＰＬＣ測定方法的建立與優(yōu)化 1.1 血漿核黃素及其衍生物的測定
根據以往建立的血漿核黃素ＨＰＬＣ測定方法４，我們進(jìn)一步探討了將該法同時(shí)應用于測定核黃素衍生物ＦＡＤ、ＦＭＮ的可能性，結果顯示核黃素、ＦＡＤ、ＦＭＮ標準（均購自Ｓｉｇｍａ公司）分離效果較好。進(jìn)一步研究我們發(fā)現ＦＭＮ、ＦＡＤ經(jīng)樣品前處理后（乙腈、三氯甲烷處理）， ＦＭＮ、ＦＡＤ標準合并成一個(gè)新的色譜峰。
根據上述方法摸索結果，我們在樣品測定過(guò)程中，標準同樣也經(jīng)乙腈、三氯甲烷處理，樣品測定時(shí)得到ＦＭＮ峰實(shí)際上為ＦＭＮ與ＦＡＤ的衍生峰，合并計算為核黃素衍生物，以ＦＭＮ標準計算，核黃素則以核黃素標準單獨計算。本法血漿ＦＭＮ回收率為９１．８±８．３％（８次），血漿核黃素回收率為１０１．４±４．８％（６次）。ＦＭＮ日內、日間ＲＳＤ（％）分別為４．４％、９．４％，核黃素日內、日間ＲＳＤ（％）分別為６．７％、１０．２％。ＦＭＮ、核黃素最低檢測限分別為２．０ ｎｍｏｌＬ、２．５ｎｍｏｌＬ。
1.2 紅細胞核黃素及其衍生物的測定
冷的生理鹽水洗滌紅細胞三次，以蒸餾水按１∶４比例懸浮紅細胞，采用超聲波細胞破碎儀破碎紅細胞制備溶血液，然后以處理血漿樣品的方法處理之，最后離心后取上清液進(jìn)行ＨＰＬＣ分析。同時(shí)測定溶血液中血紅蛋白（Ｈｂ）含量，以溶血液Ｈｂ含量校正紅細胞核黃素、核黃素衍生物（ＦＭＮ＋ＦＡＤ）的含量。以本法測得紅細胞ＦＭＮ、核黃素的回收率分別為９０．９±４．５％、１０４．９±３．８％。
２．核黃素缺乏與補充動(dòng)物試驗
2.1 材料與方法
２．１．１ 動(dòng)物與分組
健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，２月齡，體重１６０～１８０ｇ，按體重隨機分為正常對照組、正常對喂組和核黃素缺乏組，每組１０只動(dòng)物。正常對照組飼ＡＩＮ－９３Ｇ配方含核黃素飼料，核黃素缺乏組飼ＡＩＮ－９３Ｇ配方無(wú)核黃素飼料，正常對喂組與核黃素缺乏組相對喂，飼料為ＡＩＮ－９３Ｇ配方含核黃素的飼料。除了正常對喂組外，其余動(dòng)物均自由攝食，不限飲水，實(shí)驗周期４周。于實(shí)驗開(kāi)始以及每周末，收集三天尿樣，采大鼠空腹眼眶血，肝素抗凝，離心分離血漿和紅細胞，測定相關(guān)指標。進(jìn)入第５周，核黃素缺乏組動(dòng)物改飼ＡＩＮ－９３Ｇ配方含核黃素飼料，以觀(guān)察補充后恢復效果。
２．１．２ 指標測定
動(dòng)物每周體重、每日攝食量－稱(chēng)量法
ＢＧＲＡＣ－ＮＡＤＰＨ法
血紅蛋白－氰化高鐵血紅蛋白法
紅細胞還原性谷胱甘肽（ＧＳＨ）－ＤＴＮＢ顯色法，以南京建成生物公司試劑盒測定
血漿丙二醛（ＭＤＡ）－ＴＢＡ比色法
血漿核黃素及其衍生物－ＨＰＬＣ法
紅細胞核黃素及其衍生物－ＨＰＬＣ法
2.2 結果
２．２．１ 實(shí)驗期間動(dòng)物攝食量、體重的變化
與正常對照組動(dòng)物相比較，核黃素缺乏后２周內動(dòng)物攝食量變化不明顯，２周后才開(kāi)始下降。各組動(dòng)物體重出現了相似的變化，但是正常對喂組動(dòng)物下降幅度小于核黃素缺乏組，說(shuō)明核黃素缺乏組動(dòng)物體重下降的原因并不完全是攝食量下降造成，核黃素缺乏進(jìn)一步加重了動(dòng)物體重下降幅度。自由攝食后，核黃素缺乏組與正常對喂組動(dòng)物攝食量均大于正常對照組，核黃素缺乏組動(dòng)物體重有所恢復，但是，仍然顯著(zhù)低于正常對照組，正常對喂組動(dòng)物體重接近正常對照組動(dòng)物。
２．２．２ 血漿ＭＤＡ水平
實(shí)驗期間，各組之間血漿ＭＤＡ水平無(wú)顯著(zhù)差異（表２），說(shuō)明核黃素缺乏對體內脂質(zhì)過(guò)氧化沒(méi)有顯著(zhù)影響，但是，在氧化應激情況下，核黃素缺乏影響如何尚需探討。
２．２．３ 紅細胞ＧＳＨ水平
結果顯示動(dòng)物核黃素缺乏３周后紅細胞ＧＳＨ水平顯著(zhù)下降，正常對喂組動(dòng)物紅細胞ＧＳＨ水平也有所下降，說(shuō)明攝食量減少也是造成紅細胞ＧＳＨ水平下降的原因之一。改喂含核黃素的正常飼料后，核黃素缺乏動(dòng)物紅細胞ＧＳＨ水平恢復較快。
２．２．４ 尿核黃素排出量
核黃素缺乏一周后，動(dòng)物尿核黃素排出量顯著(zhù)迅速下降，４周末，核黃素缺乏動(dòng)物的尿核黃素排出量?jì)H為正常對照組動(dòng)物的１．６％。對喂組動(dòng)物尿核黃素排出量也有顯著(zhù)下降，表明攝食量減少也影響到尿核黃素排出量。改喂含核黃素的正常飼料后，核黃素缺乏動(dòng)物的尿核黃素排出量一周后尚沒(méi)有完全恢復到正常對照組動(dòng)物的水平。
２．２．５ 全血谷胱甘肽還原酶活性系數
動(dòng)物攝入核黃素缺乏飼料后，ＢＧＲＡＣ呈升高趨勢，但是，與正常對照組相比較，核黃素缺乏組動(dòng)物ＢＧＲＡＣ僅升高了２３．１％。改喂含核黃素的正常飼料后，ＢＧＲＡＣ很快恢復。正常對喂組動(dòng)物攝食量減少對ＢＧＲＡＣ影響不是十分明顯。
２．２．６ 血漿核黃素濃度
動(dòng)物攝入核黃素缺乏飼料后，血漿核黃素濃度下降顯著(zhù)，４周末僅為正常對照組的８．１％，改喂含核黃素的正常飼料后，血漿核黃素濃度迅速回升。正常對喂組動(dòng)物盡管攝食量有所下降，但是，血漿核黃素濃度下降不明顯（表１）。
２．２．７ 血漿核黃素衍生物（ＦＭＮ＋ＦＡＤ）濃度
動(dòng)物攝入核黃素缺乏飼料后，血漿核黃素衍生物濃度呈下降趨勢，但是，變化幅度明顯小于血漿核黃素濃度變化。改喂含核黃素的正常飼料后，血漿核黃素衍生物濃度迅速回升。正常對喂組動(dòng)物盡管攝食量有所下降，但是，血漿核黃素衍生物濃度下降不明顯（表２）。
２．２．８ 紅細胞核黃素濃度
核黃素缺乏以及補充恢復后動(dòng)物紅細胞核黃素濃度的變化與血漿核黃素濃度變化相類(lèi)似，４周末缺乏組動(dòng)物紅細胞核黃素濃度僅為正常對照組的４４．５％。正常對喂組動(dòng)物實(shí)驗期間盡管攝食量有所下降，但是，紅細胞核黃素濃度下降不甚明顯（表３）。
２．２．９ 紅細胞核黃素衍生物（ＦＭＮ＋ＦＡＤ）濃度
核黃素缺乏以及補充恢復后動(dòng)物紅細胞核黃素衍生物濃度的變化與血漿核黃素衍生物濃度變化相類(lèi)似，但是，下降幅度要小于核黃素濃度下降的幅度。正常對喂組動(dòng)物盡管攝食量有所下降，但是，紅細胞核黃素衍生物濃度下降不明顯（表４）。
３ 現場(chǎng)人體試驗
３．１ 一般營(yíng)養狀況及核黃素營(yíng)養狀況的調查
我們采用記賬法對某人群（６０人）進(jìn)行了為期６天的膳食調查，包括一個(gè)周末，該人群以健康男性青年為主，年齡為（２１±３）歲，集中供膳，平時(shí)擔任繁重的訓練與工作任務(wù)，屬重度勞動(dòng)強度。
結果顯示該人群維生素Ｂ２的攝入情況也不容樂(lè )觀(guān)，為參考攝入量的８５．７％，上述情況估計與該人群食物消耗構成不盡合理有關(guān)。尿核黃素含量有１人處于缺乏狀態(tài)（占１．７％），１８人處于不足狀態(tài)（占３０％），其余均處于正常狀態(tài)（占８．３％）。ＢＧＲＡＣ有４人處于不足狀態(tài)（占６．７％），其余均處于正常狀態(tài)（占９３．３％）。
６０個(gè)調查對象血漿核黃素濃度數據呈偏態(tài)分布，血漿核黃素衍生物濃度也呈偏態(tài)分布，若將調查對象中尿Ｂ２含量與ＢＧＲＡＣ缺乏與不足狀態(tài)者排除，再將剩下尿Ｂ２含量與ＢＧＲＡＣ正常者的數據轉換成正態(tài)分布，按正態(tài)分布法進(jìn)行正常值可信范圍的估計，然后再將結果轉換成原始數據，結果見(jiàn)表５，其中，血漿核黃素８０％可信正常值范圍與國外Ｈｕｓｔａｄ等的報道正常值范圍（中位數１０．５ｎｍｏｌＬ，８０％可信范圍５．４～２８．４ｎｍｏｌＬ）十分接近。
３．２ 干預試驗
選擇在調查中ＢＧＲＡＣ高于１．１２以上者１０名作為干預對象，另選擇１０名ＢＧＲＡＣ低于１．１０以下者１０名作為對照對象，干預對象服用核黃素片劑，共６天，為了排除其它維生素缺乏或不足的可能干擾，干預與對照對象均同時(shí)加服維生素Ｂ１、Ｂ６、Ｃ片以及ＡＤ和Ｅ膠丸。干預試驗結束后，采取空腹血，收取一定量晨尿，測定有關(guān)指標。
結果顯示，干預前兩組尿核黃素含量、ＢＧＲＡＣ均有顯著(zhù)差別，干預后，干預組尿核黃素含量顯著(zhù)升高，兩組ＢＧＲＡＣ也沒(méi)有顯著(zhù)差別，說(shuō)明核黃素干預效果明顯，由表６可知，核黃素干預后，能夠顯著(zhù)提高血漿核黃素濃度水平，但是，對于其衍生物（ＦＡＤ＋ＦＭＮ）濃度升高效果不明顯，提示核黃素衍生物水平的升高比較緩慢，此與動(dòng)物實(shí)驗中的結果一致。
４ 結論
４．１ 我們改進(jìn)了原有的ＨＰＬＣ測定血漿核黃素的方法，重復性及回收試驗結果良好。
４．２ 核黃素缺乏后，大鼠血漿核黃素濃度、尿核黃素排出量迅速下降，血漿核黃素衍生物含量、紅細胞核黃素及其衍生物也出現下降趨勢，但是，下降幅度小于血漿核黃素濃度及尿核黃素排出量的下降幅度；ＢＧＲＡＣ呈升高趨勢，變化幅度也明顯小于尿核黃素排出量及血漿核黃素濃度的變化幅度；核黃素缺乏動(dòng)物紅細胞ＧＳＨ含量也顯著(zhù)減少。補充核黃素恢復后，動(dòng)物血漿核黃素濃度水平恢復迅速。上述結果說(shuō)明血漿核黃素濃度是一個(gè)評定核黃素營(yíng)養狀況的敏感指標。
４．３ 我們對某核黃素營(yíng)養不良人群進(jìn)行了核黃素干預，結果顯示，服用核黃素后能夠顯著(zhù)增加尿核黃素排出量，同時(shí)，也顯著(zhù)提高血漿核黃素濃度水平，但是，對于其衍生物（ＦＡＤ＋ＦＭＮ）濃度沒(méi)有顯著(zhù)影響，說(shuō)明核黃素營(yíng)養狀況的恢復需要一定的時(shí)間，此與動(dòng)物實(shí)驗結果相一致。
４．４ 通過(guò)計算，我們初步建立了我國青年人群血漿核黃素正常參考濃度，８０％可信正常值下限為５．９７ｎｍｏｌＬ，中位數為９．７０ｎｍｏｌＬ。
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